本文關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)基因番茄 齲病 疫苗 防齲 SD大鼠　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:在獲得質(zhì)粒pET30a-PAcA以及外源基因APB-DOCK8轉(zhuǎn)基因番茄T_0代種子的基礎(chǔ)上,制備相應(yīng)的蛋白抗原多克隆抗體,應(yīng)用PCR、Western、ELISA等技術(shù)對轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)和植株進(jìn)行鑒定,對其融合蛋白含量、表達(dá)融合蛋白轉(zhuǎn)基因番茄口服免疫動物誘導(dǎo)的特異性抗體和防齲效果進(jìn)行檢測。方法:本研究包括三個部分第一部分:重組質(zhì)粒p ET30a-PAc A原核表達(dá)、蛋白純化以及抗體制備1、獲得含有重組質(zhì)粒p ET30a-PAc A的轉(zhuǎn)化子(E.coli BL21(DE3)),并加入IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。2、裂解誘導(dǎo)后的菌體,過Ni-NTA純化柱,純化鑒定誘導(dǎo)的蛋白。3、PAcA蛋白免疫新西蘭大白兔,取血,分離血清,獲得目的蛋白的多克隆抗體。第二部分:APB-DOCK8轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的基因鑒定和融合蛋白的檢測1、本實(shí)驗(yàn)對如何獲得高濃度的番茄果實(shí)DNA進(jìn)行了探索,比較了改良CTAB法和植物DNA提取試劑盒法兩種方法的效果,通過對轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行GUS檢測,篩選含有外源基因APB-DOCK8的植株。2、采用BCA法對提取的轉(zhuǎn)基因T_0、T_1代番茄果實(shí)的總蛋白進(jìn)行定量;ELISA法檢測轉(zhuǎn)基因T_0、T_1代番茄果實(shí)中融合蛋白濃度;Western blot分析融合蛋白的表達(dá)情況。與前期課題組構(gòu)建的未加入番茄果實(shí)特異性啟動子E8轉(zhuǎn)基因番茄的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,重點(diǎn)觀察融合蛋白的表達(dá)變化。第三部分:表達(dá)融合蛋白APB-DOCK8轉(zhuǎn)基因番茄口服免疫SD大鼠的實(shí)驗(yàn)研究1、動物選擇及分組:24只18 d齡SD大鼠,雌性,按隨機(jī)分組原則分為:陽性對照組8只,實(shí)驗(yàn)組8只和陰性對照組8只,建立齲齒模型。2、免疫方式、抗原及劑量:實(shí)驗(yàn)組以10 m L/kg劑量喂食含融合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁(含融合蛋白365.52μg)進(jìn)行免疫,陰性對照組按10 m L/kg劑量喂食正常組非轉(zhuǎn)基因番茄果汁,而陽性對照組喂食S.mutans UA159滅活全菌疫苗(每次1 m L,菌液濃度為1×109 CFU/m L)。3、免疫時間:從24 d開始,SD大鼠每周免疫一次,連續(xù)4周。4、樣品采集:第一次免疫前1 d及每次免疫7 d(直至12 w)后采集唾液、血液樣本,其中9 w、11 w不采集。5、特異性抗體的檢測:用間接ELISA法檢測唾液中SIgA和血清中IgG的水平。6、處死SD大鼠后取重要臟器進(jìn)行病理學(xué)檢查;取上下頜骨,根據(jù)Keyes經(jīng)典評分方法進(jìn)行齲齒計分。結(jié)果:1、優(yōu)化原核表達(dá)蛋白的條件,得到純化的可溶性BL21/p ET30a-PAc A蛋白,測定出該蛋白的濃度為0.5616 mg/m L,并制備出該蛋白的多克隆抗體。2、提取轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)DNA時,改良CTAB法比試劑盒法更為適用。GUS方法檢測轉(zhuǎn)基因番茄,顯示20株轉(zhuǎn)基因番茄植株中有15株出現(xiàn)特異性條帶,占總植株的75%。3、轉(zhuǎn)基因T_0、T_1代番茄果實(shí)總蛋白濃度分別為13.57 mg/m L、13.43 mg/m L;ELISA法檢測T_0、T_1轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的融合蛋白濃度分別為41.372μg/m L、36.552μg/m L。其外源融合蛋白所占的比例分別為0.3048%、0.2722%。同時Western印跡顯示轉(zhuǎn)基因番茄蛋白提取樣本出現(xiàn)了85 KD大小的特異性條帶,其大小正好符合APB融合蛋白預(yù)計大小。4、實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組免疫后7 d檢測發(fā)現(xiàn):動物血清中IgG和唾液SIgA抗體水平呈逐漸升高趨勢;抗體在第6 w升至最高峰,第7-8 w較為平穩(wěn),第8 w抗體水平開始明顯降低。在0-12 w實(shí)驗(yàn)組特異性SIg A抗體和陽性對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);實(shí)驗(yàn)組特異性Ig G除在10 w與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其他時間點(diǎn)均無統(tǒng)計學(xué)意義;在1-10 w陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組各特異性抗體水平與陰性對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義。陽性對照組與實(shí)驗(yàn)組齲損比較,除Ds級外其余各級無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組的齲齒計分與陰性對照組有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5、一般安全性檢測:相同時間點(diǎn)各組SD大鼠的體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陽性對照組、實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組主要臟器未見明顯的病理學(xué)改變。結(jié)論:1、重組質(zhì)粒p ET30a-PAc A能成功表達(dá)出可溶性的BL21/p ET30a-PAc A蛋白。成功制備了抗PAc A多克隆抗體,為下一步的轉(zhuǎn)基因番茄目的蛋白檢測提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2、T_1代轉(zhuǎn)基因番茄植株中篩選出含有外源目的基因APB-DOCK8的陽性植株。T_0、T_1代番茄果實(shí)內(nèi)融合蛋白APB-DOCK8表達(dá)時發(fā)生斷裂,但檢測APB蛋白成功表達(dá),且表達(dá)陽性率和表達(dá)效率都較高,APB蛋白的表達(dá)較為穩(wěn)定。3、APB-DOCK8轉(zhuǎn)基因番茄作為口服疫苗具有較好的免疫原性,免疫SD大鼠后,能誘導(dǎo)黏膜免疫和全身免疫反應(yīng),在唾液和血液中均產(chǎn)生特異性抗體,并能在一定程度上減少齲齒的發(fā)生。同時免疫動物后未觀察到明顯的危害產(chǎn)生。
[Abstract]:Objective: Based on plasmid pET30a-PAcA and APB-DOCK8 gene T_0 generation of transgenic tomato seeds, protein antigen to prepare polyclonal antibody, PCR, Western, ELISA and other techniques to identify fruit and plant transgenic tomato, the fusion protein content, expression of fusion protein in transgenic tomato oral immunization induced by specific animal antibody and anti caries effects were detected. Methods: This study includes three parts: the first part: the recombinant plasmid P ET30a-PAc A prokaryotic expression, protein purification and antibody preparation of 1 transformants obtained with the recombinant plasmid P ET30a-PAc A (E.coli BL21 (DE3)), and.2 protein expression induced by IPTG cleavage after the induction of cell, Ni-NTA purification column, purification and identification of induced protein.3, PAcA protein immunized New Zealand rabbits, blood, serum separation, polyclonal antibody to protein. The second part: AP B-DOCK8 transgenic tomato fruit gene identification and fusion protein was detected in 1, this study explores how to obtain tomato fruit by high concentrations of DNA, the kit method two different extraction methods of modified CTAB method and compare the effect of plant DNA, through GUS detection of transgenic tomato plants, screening.2 containing APB-DOCK8 gene. BCA was used to extract the total protein of T_1 generation transgenic T_0 tomato fruit quantitative detection of genetically modified T_0; ELISA method, fusion protein concentration T_1 in tomato fruit; Western blot analysis of the expression of the fusion protein. Construction and early research group did not add the tomato fruit specific promoter E8 transgenic tomato and compare the data expression of fusion protein, were observed. The third part: the expression of APB-DOCK8 fusion protein in transgenic tomato oral immunization of SD rats 1 experimental study animal and grouping: 24 鍙，

本文編號：1544685