本文關(guān)鍵詞： CREPT基因 雞 真核表達載體 多克隆抗體 DF-細胞 表達調(diào)控　出處：《農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報》2017年02期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：本研究旨在檢測CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor)基因的組織表達特異性,克隆其編碼區(qū)并構(gòu)建重組載體轉(zhuǎn)染DF-1(D fibroblast-1,DF-1)細胞并制備多克隆抗體,為初步研究雞(Gallus gallus)CREPT基因參與調(diào)控細胞周期的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。以雞生殖嵴cDNA為模板擴增CREPT基因CDS區(qū),并對該基因進行了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測和組織表達譜分析。將該基因與pcDNA3.1和pEGFP-N1載體相連獲得重組表達載體pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT之后,轉(zhuǎn)染雞DF-1細胞,并采用基因免疫法制備CREPT基因多克隆抗體并檢測效價,利用qRT-PCR檢測過表達CREPT基因后DF-1細胞內(nèi)相關(guān)基因的表達情況。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),雞CREPT編碼區(qū)序列總長978bp,編碼325個氨基酸,該氨基酸序列中存在一個RPR結(jié)構(gòu)域(regulation of nuclear pre-m RNA domain)和卷曲結(jié)構(gòu)域;以原雞(G.gallus)CDS序列為模板成功克隆的如皋黃雞(G.domesticus)CREPT基因長978 bp,測序結(jié)果準確,與原雞CDS序列一致,同源性100%;組織表達譜分析顯示,CREPT在睪丸、卵巢和大腦中m RNA表達量較高(P0.01),而在腸組織(P0.01)、骨骼肌(P0.05)和脾臟(P0.05)中的m RNA表達量較低;成功構(gòu)建重組表達載體pcDNA3.1-CREPT和pEGFP-CREPT;轉(zhuǎn)染融合表達載體pEGFP-CREPT后顯示,CREPT表達于DF-1細胞質(zhì)中;使用基因免疫法制備多克隆抗體血清,免疫熒光檢測(immunogen fluorescent assay,IFA)檢測顯示,制備的多克隆抗體最佳效價為1∶10,Western blot證實,pcDNA3.1-CREPT真核表達載體成功表達且抗血清效果良好,qPCR檢測結(jié)果表明,pcDNA3.1-CREPT載體能夠在DF-1上過表達CREPT基因,并引起細胞周期調(diào)控相關(guān)基因p15RS(P15 related gene on G1/S progression)、轉(zhuǎn)錄因子4(transcription factor 4,TCF4)、細胞周期蛋白D1(cyclinD1)和β-鏈蛋白(b-catein)的表達變化。本研究成功克隆了雞CREPT基因,并制備了具有特異性的多克隆抗體,該基因在DF-1細胞質(zhì)中表達,CREPT基因的表達能下調(diào)p15RS基因的表達(P0.01),上調(diào)TCF4(P0.05)、cyclinD1(P0.01)和b-catein(P0.01)的表達,該研究結(jié)果為進一步研究雞CREPT基因的生物學(xué)功能提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:The aim of this study was to detect the tissue expression specificity of CREPT(cell-cycle related and expression-elevated protein in tumor, clone its coding region and construct a recombinant vector to transfect DF-1(D fibroblast-1 DF-1 cells and prepare polyclonal antibodies. To provide theoretical basis for the preliminary study of the biological function of chicken Gallus gallus)CREPT gene involved in the regulation of cell cycle, the CDS region of CREPT gene was amplified by using chicken reproductive crest cDNA as template. The protein structure and tissue expression profile of the gene were predicted and analyzed. The recombinant expression vectors pcDNA3.1-CREPT and pEGFP-CREPT were obtained by connecting the gene with pcDNA3.1 and pEGFP-N1 vectors, and then transfected into chicken DF-1 cells. The polyclonal antibody of CREPT gene was prepared by gene immunoassay and its titer was detected. The expression of related genes in DF-1 cells was detected by qRT-PCR after the expression of CREPT gene. The total length of chicken CREPT coding region was 978 BP, encoding 325 amino acids, and there was a RPR domain regulation of nuclear pre-m RNA domain and curl domain in the amino acid sequence. The expression of m RNA in testis, ovaries and cerebrum was higher than that in intestinal tissues (P0.01), skeletal muscle (P0.05) and spleen (P0.05). The recombinant expression vectors pcDNA3.1-CREPT and pEGFP-CREPTwere successfully constructed, and the fusion expression vector pEGFP-CREPT was transfected into the cytoplasm of DF-1. The best titer of the polyclonal antibody was 1: 10 Western blot. The eukaryotic expression vector pcDNA3.1-CREPT was successfully expressed and the antiserum effect was good. The results showed that the pcDNA3.1-CREPT vector could overexpress the CREPT gene on DF-1. The expression changes of cell cycle regulation related gene p15RSSv P15 related gene on G 1 / S progression, transcription factor 4 related factor 4T CF4, cyclin D 1 and 尾 -chain protein B catein) were induced. Chicken CREPT gene was cloned and specific polyclonal antibody was prepared. The expression of this gene in the cytoplasm of DF-1 could down-regulate the expression of p15RS gene, up-regulate the expression of p15RS gene and up-regulate the expression of cyclin D1 and b-catein P0.01). The results provided a theoretical basis for further study on the biological function of chicken CREPT gene.
【作者單位】： 揚州大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(No.31472087、No.31301959和No.31272429) 中國博士后基金(No.2012M511326和No.2014T70550) 江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目 揚州大學(xué)大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金(No.x20160682)
【分類號】：Q78;S831

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