本文關(guān)鍵詞： AID基因 DNA去甲基化 牛胎兒成纖維細胞 轉(zhuǎn)基因克隆 體外受精 5-Aza-CdR　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：哺乳動物精子與卵母細胞融合后,基因組開始劇烈的表觀遺傳重編程。首先,來自父本基因組的雄原核在沒有分裂的情況下迅速的去除DNA甲基化,母本基因組則隨著DNA復(fù)制,發(fā)生被動DNA去甲基化。父本基因組的這種不依賴DNA復(fù)制、主動迅速的DNA去甲基化需要有DNA去甲基化酶的催化。早期胚胎發(fā)育過程中的這些DNA去甲基化及重新甲基化過程,為研究DNA甲基化對基因表達的影響以及與早期胚胎發(fā)育全能性的相互關(guān)系,提供了很好的時間窗口。DNA甲基化去除的方式主要有兩種,一種是DNA復(fù)制依賴,另一種就是經(jīng)酶催化的主動DNA去甲基化,使5甲基胞嘧啶(5mC)直接轉(zhuǎn)化為未甲基化的胞嘧啶。目前,在哺乳動物中還沒有明確具有DNA去甲基化作用的物質(zhì),并且也不確定DNA主動去甲基化作用的途徑�；罨T導(dǎo)的胞苷脫氨酶(activa-tion induced cytidine deaminase, AID,亦稱為AICDA)具有使單鏈DNA上的5mC和5C脫氨基為T的能力。AID因其在B淋巴細胞中產(chǎn)生抗體多樣性的作用而被廣泛認(rèn)識。最近,在斑馬魚和小鼠受精過程中的研究發(fā)現(xiàn)AID脫氨基作用產(chǎn)生的T能夠通過堿基切除修復(fù)(base-excision repair, BER)途徑修復(fù),從而實現(xiàn)其DNA主動去甲基化的作用。同時有研究表明AID是OCT4和NANOG這些多能基因啟動子區(qū)DNA主動去甲基化所必需的因子。但是由于AID對5mC的脫氨基作用效率遠遠低于5C,因此其DNA去甲基化作用存在爭議。為了進一步研究AID在哺乳動物細胞中DNA主動去甲基化作用,本研究檢測了AID在牛不同組織、卵母細胞及著床前胚胎中的表達調(diào)節(jié),比較分析了不同時期卵母細胞及體外受精胚胎早期發(fā)育過程中AID基因啟動子區(qū)DNA甲基化的動態(tài)變化,并通過基因過表達、基因敲減技術(shù)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR的處理,系統(tǒng)的研究了AID在重編程過程中的作用及其對胚胎發(fā)育的影響。1.牛早期胚胎發(fā)育中AID基因的表達及其調(diào)節(jié)區(qū)DNA甲基化的動態(tài)變化本研究首先通過檢測AID基因在牛4種組織中的表達和其啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)的變化,確定了AID基因的組織依賴分化特異性DNA甲基化調(diào)節(jié)區(qū)(tissue-dependent and differentially methylated region, T-DMR)位于其基因編碼區(qū)(coding sequence, CDS)上游-88bp～431bp。AID基因的表達具有組織特異性,睪丸組織的表達水平明顯高于心臟、腎臟和肝臟；而睪丸組織AID基因T-DMR區(qū)的DNA甲基化程度較其它3種組織低,結(jié)果表明,AID基因的T-DMR區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)與其表達水平相關(guān)。隨后,本研究檢測了卵母細胞成熟過程及著床前胚胎早期發(fā)育過程AID基因的表達及其T-DMR區(qū)的甲基化狀態(tài)。卵母細胞成熟過程中,從GV期到MII期AID基因逐漸積累,MII期表達量達到峰值；此時,AID基因T-DMR區(qū)的第2和第3號CpG位點的DNA甲基化有一個明顯的去除過程,而其他位點都未發(fā)生變化。隨著精子入卵,受精卵開始細胞分裂,AID基因的表達量急劇下降,直到8-cell時期,也即母型合子轉(zhuǎn)變期,AID基因表達再次逐漸升高。在這一過程中,AID基因的T-DMR區(qū)除了第2和第3號CpG位點一直都維持未甲基化狀態(tài)外,其他位點都是甲基化的狀態(tài)。通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),從GV期卵母細胞到桑椹胚,AID蛋白都是均勻分布于細胞核和細胞質(zhì)中。而囊胚時期大量的AID蛋白集中于內(nèi)細胞團,這可能對內(nèi)細胞團多能性的維持起重要作用。綜上所述,卵母細胞成熟中積累的AID作用于受精過程,其啟動子區(qū)的DNA去甲基化與AID基因的表達有關(guān)。胚胎基因組激活后AID基因的表達可能與胚胎發(fā)育有關(guān),其作用還有待研究。2.AID的DNA去甲基化作用對牛卵母細胞及體細胞核移植胚胎早期發(fā)育的影響本研究利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)和顯微注射技術(shù),探討AID的DNA去甲基化作用對牛卵母細胞成熟及體細胞核移植胚胎早期發(fā)育的影響。本實驗構(gòu)建并獲得了有功能的AID基因過表達載體pCDsRed-PbAID,使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染細胞后,利用G418篩選得到5個轉(zhuǎn)基因克隆,經(jīng)PCR鑒定后用于轉(zhuǎn)基因體細胞核移植實驗。研究結(jié)果顯示,AID基因的過表達不能改變轉(zhuǎn)基因細胞整體的DNA甲基化,但可改變OCT4、NANOG、SOX2和CDX2的啟動子區(qū)甲基化狀態(tài),從而改變這些基因的表達。利用轉(zhuǎn)AID基因細胞作為供體細胞能夠顯著提高體細胞克隆胚胎的卵裂率、桑椹胚率和囊胚率。檢測轉(zhuǎn)基因克隆囊胚OCT4、NANOG、SOX2的表達量,發(fā)現(xiàn)都有不同程度的提高。同時這些基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)都有所降低,說明AID的DNA去甲基化作用具有位點特異性。為分析AID基因在牛卵母細胞成熟及體外受精胚早期發(fā)育過程中的作用,以AID基因mRNA作為設(shè)計模板設(shè)計了三條AID基因的干擾片段,并利用顯微注射的方法在GV期注入牛卵母細胞,敲減后AID基因的表達量下降到26.7%。注射后AID基因表達量的降低并未影響牛卵母細胞的成熟率和體外受精胚胎的發(fā)育率,但是AID基因的敲減改變了OCT4、NANOG、SOX2的表達量和其啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。免疫熒光檢測結(jié)果顯示,在注射AID干擾片段后,5-mC和5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)在受精后原核期的表達和定位都沒有明顯變化,提示AID的DNA去甲基化作用可能不通過5-hmC通路。上述過表達和干擾的研究表明,AID在牛的成纖維細胞和體外受精胚胎中具有去甲基化的作用,但AID的去甲基化作用不是全基因組的DNA去甲基化而是有選擇性地針對特定基因位點,如OCT4.NANOG和SOX2等基因的特異性DNA去甲基化。3.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR對AID基因修飾成纖維細胞重編程的影響本研究使用1、2、3、4、5 μM不同濃度5-Aza-CdR處理轉(zhuǎn)AID基因細胞和AID基因敲減細胞,并對細胞形態(tài)、細胞周期、多能性相關(guān)基因表達及其基因啟動子區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)的變化進行了分析。結(jié)果表明,5-Aza-CdR對轉(zhuǎn)基因供體細胞的影響是劑量依賴的,當(dāng)濃度達到4 μM時,細胞大量死亡(P0.05)。核型分析顯示,3 μM濃度組處理就可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因細胞出現(xiàn)異常核型。使用1μM濃度處理細胞,明顯增加了表達報告基因細胞的數(shù)量,細胞AID和SOX2的表達量都有所提高,并且SOX2基因啟動子區(qū)發(fā)生DNA去甲基化。5-Aza-CdR處理的AID基因敲減細胞,其OCT4和SOX2的表達量較對照組明顯升高,而NANOG卻沒有發(fā)生變化。綜上所述,5-Aza-CdR的基因組整體去甲基化與AID基因的位點特異性去甲基化對于體細胞重編程都具有重要的作用,在特定基因位點這兩種作用可以相互補充,二者聯(lián)合處理供體細胞可能更有利于體細胞重編程效率的提高。
[Abstract]:In order to study the effect of AID on gene expression and its influence on embryo development , it has been found that AID is an important way to demethylation of DNA . In order to study the effect of AID on gene expression and its influence on embryo development in early embryo development , it has been found that AID is a DNA replication dependent . In order to further study the effect of AID on gene expression and its effect on embryo development . The effect of AID gene on early development of bovine oocytes and somatic cell nuclear transfer embryos was investigated by means of immunofluorometric assay . The results showed that the effect of 5 - Aza - CdR on transgenic donor cells was dose dependent .

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q954.4

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本文編號：1520107