本文關(guān)鍵詞： 美國(guó)白蛾 CRISPR/Cas Wnt- 基因組編輯 免疫組化 體節(jié)形成 附肢發(fā)育　出處：《林業(yè)科學(xué)》2017年03期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：【目的】為了從分子水平上揭示美國(guó)白蛾飛行能力的機(jī)制,利用基因組編輯技術(shù)對(duì)翅形成相關(guān)基因Wnt-1進(jìn)行功能研究�！痉椒ā扛鶕�(jù)美國(guó)白蛾的基因組和轉(zhuǎn)錄組信息設(shè)計(jì)引物,克隆得到HcWnt-1基因CDS區(qū)全長(zhǎng),利用在線軟件分析HcWNT-1蛋白的結(jié)構(gòu)特征;通過RT-PCR確定該基因在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中的時(shí)間表達(dá)模式,并通過免疫組化方法確定HcWNT-1蛋白的時(shí)空表達(dá)模式;通過CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)HcWnt-1基因進(jìn)行編輯,觀察胚胎期突變體表型和基因型特點(diǎn),利用直接PCR和陽性克隆測(cè)序檢測(cè)HcWnt-1基因突變�！窘Y(jié)果】HcWnt-1基因核苷酸序列大小為1 221 bp,編碼407個(gè)氨基酸,HcWNT-1蛋白含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合基序和24個(gè)保守的半胱氨酸殘基,并且高度保守的Motif分散分布于整個(gè)序列。轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平驗(yàn)證表明:美國(guó)白蛾HcWnt-1基因在胚胎早期高表達(dá),且其表達(dá)水平隨著體節(jié)分化和附肢發(fā)育而呈時(shí)序性變化;24 h時(shí),早期胚帶形成,轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)第1個(gè)表達(dá)高峰,HcWNT-1蛋白表達(dá)主要集中于原頭區(qū);隨著胚胎的發(fā)育,HcWnt-1基因表達(dá)水平逐漸下降,HcWNT-1蛋白表達(dá)沿著前后體軸由頭部向尾部逐漸延伸;在144 h,轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)第2個(gè)表達(dá)高峰,HcWNT-1蛋白表達(dá)主要集中于附肢。美國(guó)白蛾HcWnt-1基因的突變?cè)斐闪伺咛テ?9.8%的個(gè)體死亡(注射1 000頭),突變率為62.5%,PCR測(cè)序結(jié)果顯示2個(gè)靶點(diǎn)之間存在片段刪除,最大刪除片段為423 bp;大部分突變體不能形成胚胎,少數(shù)能形成胚胎的個(gè)體體節(jié)形成異常和附肢發(fā)育受阻�！窘Y(jié)論】美國(guó)白蛾胚胎發(fā)育類型符合短胚帶和中間胚帶型;CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)可以對(duì)美國(guó)白蛾基因組進(jìn)行高效編輯,可為林業(yè)以及非模式害蟲基因功能研究提供理論支持;HcWnt-1基因敲除影響美國(guó)白蛾體節(jié)分化和附肢形成,說明該基因?qū)τ诿绹?guó)白蛾胚胎發(fā)育至關(guān)重要。此外,HcWnt-1突變?cè)斐擅绹?guó)白蛾胚胎期死亡,可作為未來美國(guó)白蛾遺傳防治的靶標(biāo)基因。
[Abstract]:[objective] in order to reveal the mechanism of flying ability of American white moth at molecular level, the function of Wnt-1, a gene related to wing formation, was studied by genomic editing technique. [methods] Primer was designed according to the genomic and transcriptional information of White moth. The full-length CDS region of HcWnt-1 gene was cloned, the structural characteristics of HcWNT-1 protein were analyzed by on-line software, the time expression pattern of the gene during its growth and development was determined by RT-PCR, and the temporal and spatial expression pattern of HcWNT-1 protein was determined by immunohistochemical method. The HcWnt-1 gene was edited by CRISPR/Cas9 technique to observe the surface type and genotypic characteristics of embryonic mutant. Direct PCR and positive clone sequencing were used to detect the mutation of HcWnt-1 gene. [results] the nucleotide sequence of HcWnt-1 gene was 1 221 BP, encoding 407 amino acids HcWNT-1 protein containing helico-turn-helical DNA binding motif and 24 conserved cysteine residues. The highly conserved Motif was distributed throughout the whole sequence. Transcriptional and translational level verification showed that HcWnt-1 gene was highly expressed in early embryonic stage, and its expression level changed chronically with somatic ganglion differentiation and appendage development for 24 h. The expression of HcWNT-1 protein was mainly concentrated in the primordial region, and the expression level of HcWnt-1 gene gradually decreased with the development of embryo, and the expression of HcWNT-1 protein gradually extended from head to tail along the axis of anterior and posterior body. At 144h, the second peak of HcWNT-1 expression at transcription level was mainly found in the appendages. The mutation of HcWnt-1 gene caused the death of 99.8% individuals at embryonic stage. There is a fragment deletion between the target points, The maximum deleted fragment was 423 BP; most of the mutants could not form embryos. A few individuals who can form embryos have abnormal somatic formation and obstructed appendage development. [conclusion] the embryonic development types of American white moth are consistent with the short embryo band and intermediate embryo band type CRISPR-Cas9 genome editing technique, which can be used to efficiently edit the genome of the American white moth. HcWnt-1 gene knockout may affect the somatic node differentiation and appendage formation of the moth, which may provide theoretical support for the study of gene function of forestry and non-model pests. In addition, HcWnt-1 mutation resulted in embryo death, which could be used as a target gene for genetic control of White Moth in the future.
【作者單位】： 國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所;中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心;中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所昆蟲發(fā)育與進(jìn)化生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201504302)
【分類號(hào)】：S763.42

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本文編號(hào)：1520100