本文關(guān)鍵詞： 壓應(yīng)力 軟骨細(xì)胞 組蛋白脫乙�；�4 基因表達(dá) 蛋白磷酸酶2A　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:關(guān)節(jié)軟骨覆蓋在關(guān)節(jié)表面,是關(guān)節(jié)實現(xiàn)正常功能的重要結(jié)構(gòu)。關(guān)節(jié)軟骨的組成成分包括軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì),細(xì)胞外基質(zhì)主要包括膠原和蛋白多糖,而細(xì)胞成分只有軟骨細(xì)胞一種。軟骨細(xì)胞可分泌新基質(zhì),并降解老化和受損的基質(zhì),以維持軟骨結(jié)構(gòu)的完整性。負(fù)重是關(guān)節(jié)軟骨的基本功能,關(guān)節(jié)負(fù)重首先使關(guān)節(jié)軟骨受到直接的壓應(yīng)力。研究顯示力學(xué)應(yīng)力可調(diào)節(jié)軟骨的基因表達(dá)。正常生理應(yīng)力可促進(jìn)軟骨表型相關(guān)基因的表達(dá)和基質(zhì)蛋白分泌。相反,異常的機(jī)械應(yīng)力(如應(yīng)力過大或喪失)可誘發(fā)或促進(jìn)軟骨的退變,軟骨退變最終會導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎。雖然大量研究都證實力學(xué)應(yīng)力和軟骨有密切的關(guān)系,但是力學(xué)傳導(dǎo)的機(jī)制,即軟骨細(xì)胞如何感應(yīng)和傳導(dǎo)力學(xué)信號,仍然不明了。組蛋白去乙�；�4(HDAC4)特異性地分布在腦組織、心肌組織、骨骼肌肉和軟骨組織中。敲除HDAC4的基因鼠表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞早期、異常的肥大,和異位骨化,最終在出生前后死亡。HDAC4有一奇特能力,可在細(xì)胞核和細(xì)胞漿之間穿梭。已有的研究顯示,HDAC4在細(xì)胞核內(nèi)外的穿梭對肌肉細(xì)胞分化,神經(jīng)細(xì)胞功能的發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用。我們實驗室以往的研究顯示,HDAC4細(xì)胞核內(nèi)外的穿梭在生長板骺軟骨細(xì)胞的分化中起決定性的調(diào)節(jié)作用。但還不清楚,機(jī)械應(yīng)力是否能誘導(dǎo)HDAC4核內(nèi)外移動。本研究旨在觀察壓應(yīng)力對HDAC4細(xì)胞核內(nèi)外移動的影響,及HDAC4細(xì)胞核內(nèi)外的移動在力學(xué)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)中的作用。目的:(1)應(yīng)用Flexcell?FX-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加壓應(yīng)力,觀察壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)外移動的影響。(2)應(yīng)用Flexcell?FX-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加壓應(yīng)力,分析壓應(yīng)力引起的hdac4核內(nèi)外移動對軟骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響,探討hdac4核內(nèi)外移動在壓應(yīng)力調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)中的作用。(3)應(yīng)用flexcell?fx-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)和軟骨細(xì)胞體外立體培養(yǎng),探討壓應(yīng)力誘導(dǎo)hdac4核內(nèi)外移動的機(jī)制,及hdac4核內(nèi)外移動調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)的機(jī)制。方法:本課題包括以下五方面研究:(1)軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)及壓應(yīng)力作用時間的選擇。包括以下幾方面內(nèi)容:(1)6天齡幼鼠(c57bl/6)軟骨細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng);(2)綠色熒光蛋白(gfp)標(biāo)記的hdac4(gfp-hdac4)腺病毒載體的體外擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的鼠軟骨細(xì)胞;(3)將轉(zhuǎn)染gfp-hdac4的軟骨細(xì)胞移至2%藻酸鹽水凝膠中,繼續(xù)立體培養(yǎng);(4)應(yīng)用flexcell?fx-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng),對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加壓應(yīng)力,觀察不同作用時間對基因表達(dá)的影響,以選擇最佳的負(fù)載時間。(2)觀察壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞內(nèi)hdac4核內(nèi)外分布的影響。主要實驗內(nèi)容如下:(1)應(yīng)用flexcell?fx-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng),對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加最佳負(fù)載時間的壓應(yīng)力,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)hdac4核內(nèi)外分布的變化;(2)對受力后軟骨細(xì)胞的細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白進(jìn)行分離提取,應(yīng)用west-blot分析細(xì)胞漿內(nèi)hdac4和細(xì)胞核內(nèi)hdac4含量在壓應(yīng)力作用前后的變化。(3)觀察壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞代謝、增殖及分化的影響。具體實驗內(nèi)容如下:(1)應(yīng)用rt-pcr檢測軟骨細(xì)胞受到壓應(yīng)力后蛋白聚糖、ii型膠原、lk1、sox9、cdkn1a、x型膠原、mmp-13、ihh和runx2基因表達(dá)的變化;(2)應(yīng)用safranin-o染色評價壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞分泌蛋白多糖的影響,應(yīng)用west-blot評價壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞分泌ii型膠原的影響;(3)應(yīng)用edu細(xì)胞增殖檢測法評價應(yīng)力對軟骨細(xì)胞增殖的影響;(4)進(jìn)一步行i型膠原和ii型膠原免疫組織化學(xué)染色,評價應(yīng)力對軟骨細(xì)胞分化的作用。(4)探討壓應(yīng)力誘導(dǎo)hdac4細(xì)胞核內(nèi)外再分布的機(jī)制。實驗內(nèi)容有:(1)首先,應(yīng)用免疫共沉淀和west-blot檢測壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞內(nèi)hdac4磷酸化的影響;(2)然后,應(yīng)用蛋白磷酸酶2a(pp2a)免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒觀察壓應(yīng)力對pp2a活性的影響。(5)應(yīng)用pp2a抑制劑,岡田酸(okadaicacid,oa),進(jìn)一步證實壓應(yīng)力促進(jìn)hdac4細(xì)胞核內(nèi)外移動是通過pp2a去磷酸化hdac4途徑來調(diào)控的。又分以下幾個實驗:(1)驗證pp2a抑制劑,oa,阻止壓應(yīng)力誘導(dǎo)的hdac4細(xì)胞核內(nèi)移。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)hdac4核內(nèi)外分布的變化,分離提取受力后軟骨細(xì)胞的細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白,應(yīng)用west-blot分析細(xì)胞漿hdac4和細(xì)胞核hdac4含量在壓應(yīng)力作用后的變化;(2)證實是否oa抑制壓應(yīng)力誘導(dǎo)的hdac4去磷酸化。應(yīng)用hdac4抗體對分離的軟骨細(xì)胞核、漿蛋白進(jìn)行免疫共沉淀,之后應(yīng)用抗磷酸化絲氨酸的抗體進(jìn)行west-blot檢測磷酸化的hdac4。(3)應(yīng)用pp2a免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒,檢測oa是否抑制pp2a活性;(4)應(yīng)用rt-pcr觀察oa是否抑制壓應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞基因表達(dá)變化;(5)應(yīng)用hoechst33342/propidiumiodide(pi)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,觀察oa是否誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞死亡。結(jié)果:(1)軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)及壓應(yīng)力最佳作用時間。(1)鼠軟骨細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)成功;(2)含gfp-hdac4腺病毒載體的體外擴(kuò)增成功,并可對體外培養(yǎng)鼠軟骨細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染;(3)轉(zhuǎn)染gfp-hdac4的軟骨細(xì)胞在2%藻酸鹽水凝膠中立體培養(yǎng)生長良好,激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,在2%藻酸鹽水凝膠中立體培養(yǎng)一周,軟骨細(xì)胞gfp-hdac4的表達(dá)率約89.8%(86.9%~92.6%);(4)應(yīng)用flexcell?fx-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng),對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加壓應(yīng)力:0.5hz正弦波形變化,0~20kpa壓應(yīng)力強(qiáng)度變化(0.5hz,20kpa),施壓2小時和3小時時間點蛋白多糖和ii型膠原的mrna表達(dá)都明顯增加(p0.05),但施壓4小時后mrna表達(dá)較3小時時間點減少(p0.05),因此選擇3小時壓應(yīng)力(0.5hz,20kpa)作為負(fù)載條件。(2)壓應(yīng)力促進(jìn)hdac4進(jìn)入軟骨細(xì)胞核。(1)激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,在未受力的立體培養(yǎng)軟骨細(xì)胞中,hdac4主要分布在細(xì)胞漿;而在受到3個小時壓應(yīng)力的軟骨細(xì)胞中,hdac4主要分布在細(xì)胞核。比較hdac4主要分布在細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞數(shù),受應(yīng)力組明顯高于未受應(yīng)力組(p=0.009)。(2)免疫共沉淀實驗進(jìn)一步證實,細(xì)胞漿內(nèi)hdac4蛋白含量,未受力組明顯高于受力組;而細(xì)胞核內(nèi)的hdac4蛋白含量,受力組明顯高于未受力組。這些實驗證實,壓應(yīng)力誘導(dǎo)hdac4從細(xì)胞漿移動到細(xì)胞核。(3)壓應(yīng)力調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)。(1)rt-pcr檢測顯示,軟骨細(xì)胞受到壓應(yīng)力后蛋白聚糖、ii型膠原、lk1和sox9的mrna表達(dá)顯著升高(p0.05),而cdkn1a、x型膠原、mmp-13、ihh和runx2的mrna表達(dá)顯著降低(p0.05);(2)safranin-o染色顯示,壓應(yīng)力組軟骨細(xì)胞周圍的紅染程度比對照組顯著深;west-blot檢測顯示,壓應(yīng)力組的ii型膠原蛋白量明顯高于對照組;(3)edu檢測顯示,壓應(yīng)力組細(xì)胞的陽性率明顯高于對照組(p=0.0047);(4)免疫組織化學(xué)染色顯示,壓應(yīng)力組細(xì)胞的ii型膠原染色陽性,i型膠原染色陰性。以上結(jié)果證實壓應(yīng)力促進(jìn)軟骨細(xì)胞的代謝和增殖,并抑制其分化。(4)壓應(yīng)力使hdac4去磷酸化,并增加pp2a活性。(1)免疫共沉淀和west-blot檢測顯示,壓應(yīng)力可使軟骨細(xì)胞內(nèi)hdac4去磷酸化;(2)pp2a免疫沉淀磷酸酶檢測顯示,壓應(yīng)力可增加pp2a活性。(5)岡田酸(okadaicacid,oa)抑制實驗。(1)oa阻止壓應(yīng)力誘導(dǎo)的hdac4細(xì)胞核內(nèi)移。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,添加抑制劑oa后,軟骨細(xì)胞受到壓應(yīng)力,hdac4仍然主要分布在細(xì)胞漿。west-blot分析顯示,添加抑制劑oa后,軟骨細(xì)胞即使受到壓應(yīng)力,細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的hdac4含量與未受壓應(yīng)力的對照組相比變化也不明顯;(2)免疫共沉淀和west-blot檢測證實,加抑制劑oa后壓應(yīng)力不能使hdac4去磷酸化;(3)pp2a免疫沉淀磷酸酶檢測顯示,加oa后壓應(yīng)力不能增加pp2a活性;(4)rt-pcr檢測顯示,與壓應(yīng)力組比較,oa+壓應(yīng)力組中蛋白聚糖、ii型膠原、lk1和sox9的mrna表達(dá)顯著降低(p0.05),而cdkn1a、x型膠原、mmp-13、ihh和runx2的mrna表達(dá)顯著增高(p0.05);(5)應(yīng)用hoechst33342/propidiumiodide(pi)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒觀察顯示,oa不誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞死亡。結(jié)論:本實驗首次發(fā)現(xiàn):(1)壓應(yīng)力可促進(jìn)hdac4由細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核;(2)hdac4進(jìn)入細(xì)胞核后,可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá),壓應(yīng)力通過促進(jìn)hdac4進(jìn)入細(xì)胞核來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá);(3)壓應(yīng)力通過增加PP2A活性,去磷酸化HDAC4,來調(diào)節(jié)HDAC4進(jìn)入細(xì)胞核。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R684

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本文編號：1515536