本文關鍵詞： 壓應力 軟骨細胞 組蛋白脫乙�；�4 基因表達 蛋白磷酸酶2A　出處：《山西醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:關節(jié)軟骨覆蓋在關節(jié)表面,是關節(jié)實現正常功能的重要結構。關節(jié)軟骨的組成成分包括軟骨細胞和細胞外基質,細胞外基質主要包括膠原和蛋白多糖,而細胞成分只有軟骨細胞一種。軟骨細胞可分泌新基質,并降解老化和受損的基質,以維持軟骨結構的完整性。負重是關節(jié)軟骨的基本功能,關節(jié)負重首先使關節(jié)軟骨受到直接的壓應力。研究顯示力學應力可調節(jié)軟骨的基因表達。正常生理應力可促進軟骨表型相關基因的表達和基質蛋白分泌。相反,異常的機械應力(如應力過大或喪失)可誘發(fā)或促進軟骨的退變,軟骨退變最終會導致骨關節(jié)炎。雖然大量研究都證實力學應力和軟骨有密切的關系,但是力學傳導的機制,即軟骨細胞如何感應和傳導力學信號,仍然不明了。組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)特異性地分布在腦組織、心肌組織、骨骼肌肉和軟骨組織中。敲除HDAC4的基因鼠表現為軟骨細胞早期、異常的肥大,和異位骨化,最終在出生前后死亡。HDAC4有一奇特能力,可在細胞核和細胞漿之間穿梭。已有的研究顯示,HDAC4在細胞核內外的穿梭對肌肉細胞分化,神經細胞功能的發(fā)揮起著重要的調節(jié)作用。我們實驗室以往的研究顯示,HDAC4細胞核內外的穿梭在生長板骺軟骨細胞的分化中起決定性的調節(jié)作用。但還不清楚,機械應力是否能誘導HDAC4核內外移動。本研究旨在觀察壓應力對HDAC4細胞核內外移動的影響,及HDAC4細胞核內外的移動在力學調節(jié)軟骨細胞基因表達中的作用。目的:(1)應用Flexcell?FX-5000?壓應力加載系統(tǒng)對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加壓應力,觀察壓應力對軟骨細胞內HDAC4核內外移動的影響。(2)應用Flexcell?FX-5000?壓應力加載系統(tǒng)對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加壓應力,分析壓應力引起的hdac4核內外移動對軟骨細胞基因表達的影響,探討hdac4核內外移動在壓應力調節(jié)軟骨細胞基因表達中的作用。(3)應用flexcell?fx-5000?壓應力加載系統(tǒng)和軟骨細胞體外立體培養(yǎng),探討壓應力誘導hdac4核內外移動的機制,及hdac4核內外移動調節(jié)軟骨細胞基因表達的機制。方法:本課題包括以下五方面研究:(1)軟骨細胞立體培養(yǎng)及壓應力作用時間的選擇。包括以下幾方面內容:(1)6天齡幼鼠(c57bl/6)軟骨細胞的分離和體外培養(yǎng);(2)綠色熒光蛋白(gfp)標記的hdac4(gfp-hdac4)腺病毒載體的體外擴增和轉染體外培養(yǎng)的鼠軟骨細胞;(3)將轉染gfp-hdac4的軟骨細胞移至2%藻酸鹽水凝膠中,繼續(xù)立體培養(yǎng);(4)應用flexcell?fx-5000?壓應力加載系統(tǒng),對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加壓應力,觀察不同作用時間對基因表達的影響,以選擇最佳的負載時間。(2)觀察壓應力對軟骨細胞內hdac4核內外分布的影響。主要實驗內容如下:(1)應用flexcell?fx-5000?壓應力加載系統(tǒng),對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加最佳負載時間的壓應力,應用激光共聚焦顯微鏡觀察軟骨細胞內hdac4核內外分布的變化;(2)對受力后軟骨細胞的細胞漿蛋白和細胞核蛋白進行分離提取,應用west-blot分析細胞漿內hdac4和細胞核內hdac4含量在壓應力作用前后的變化。(3)觀察壓應力對軟骨細胞代謝、增殖及分化的影響。具體實驗內容如下:(1)應用rt-pcr檢測軟骨細胞受到壓應力后蛋白聚糖、ii型膠原、lk1、sox9、cdkn1a、x型膠原、mmp-13、ihh和runx2基因表達的變化;(2)應用safranin-o染色評價壓應力對軟骨細胞分泌蛋白多糖的影響,應用west-blot評價壓應力對軟骨細胞分泌ii型膠原的影響;(3)應用edu細胞增殖檢測法評價應力對軟骨細胞增殖的影響;(4)進一步行i型膠原和ii型膠原免疫組織化學染色,評價應力對軟骨細胞分化的作用。(4)探討壓應力誘導hdac4細胞核內外再分布的機制。實驗內容有:(1)首先,應用免疫共沉淀和west-blot檢測壓應力對軟骨細胞內hdac4磷酸化的影響;(2)然后,應用蛋白磷酸酶2a(pp2a)免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒觀察壓應力對pp2a活性的影響。(5)應用pp2a抑制劑,岡田酸(okadaicacid,oa),進一步證實壓應力促進hdac4細胞核內外移動是通過pp2a去磷酸化hdac4途徑來調控的。又分以下幾個實驗:(1)驗證pp2a抑制劑,oa,阻止壓應力誘導的hdac4細胞核內移。應用激光共聚焦顯微鏡觀察軟骨細胞內hdac4核內外分布的變化,分離提取受力后軟骨細胞的細胞漿蛋白和細胞核蛋白,應用west-blot分析細胞漿hdac4和細胞核hdac4含量在壓應力作用后的變化;(2)證實是否oa抑制壓應力誘導的hdac4去磷酸化。應用hdac4抗體對分離的軟骨細胞核、漿蛋白進行免疫共沉淀,之后應用抗磷酸化絲氨酸的抗體進行west-blot檢測磷酸化的hdac4。(3)應用pp2a免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒,檢測oa是否抑制pp2a活性;(4)應用rt-pcr觀察oa是否抑制壓應力誘導的軟骨細胞基因表達變化;(5)應用hoechst33342/propidiumiodide(pi)雙染細胞凋亡檢測試劑盒,觀察oa是否誘導軟骨細胞死亡。結果:(1)軟骨細胞立體培養(yǎng)及壓應力最佳作用時間。(1)鼠軟骨細胞分離和體外培養(yǎng)成功;(2)含gfp-hdac4腺病毒載體的體外擴增成功,并可對體外培養(yǎng)鼠軟骨細胞高效轉染;(3)轉染gfp-hdac4的軟骨細胞在2%藻酸鹽水凝膠中立體培養(yǎng)生長良好,激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,在2%藻酸鹽水凝膠中立體培養(yǎng)一周,軟骨細胞gfp-hdac4的表達率約89.8%(86.9%~92.6%);(4)應用flexcell?fx-5000?壓應力加載系統(tǒng),對體外立體培養(yǎng)的軟骨細胞施加壓應力:0.5hz正弦波形變化,0~20kpa壓應力強度變化(0.5hz,20kpa),施壓2小時和3小時時間點蛋白多糖和ii型膠原的mrna表達都明顯增加(p0.05),但施壓4小時后mrna表達較3小時時間點減少(p0.05),因此選擇3小時壓應力(0.5hz,20kpa)作為負載條件。(2)壓應力促進hdac4進入軟骨細胞核。(1)激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,在未受力的立體培養(yǎng)軟骨細胞中,hdac4主要分布在細胞漿;而在受到3個小時壓應力的軟骨細胞中,hdac4主要分布在細胞核。比較hdac4主要分布在細胞核內的細胞數,受應力組明顯高于未受應力組(p=0.009)。(2)免疫共沉淀實驗進一步證實,細胞漿內hdac4蛋白含量,未受力組明顯高于受力組;而細胞核內的hdac4蛋白含量,受力組明顯高于未受力組。這些實驗證實,壓應力誘導hdac4從細胞漿移動到細胞核。(3)壓應力調節(jié)軟骨細胞基因表達。(1)rt-pcr檢測顯示,軟骨細胞受到壓應力后蛋白聚糖、ii型膠原、lk1和sox9的mrna表達顯著升高(p0.05),而cdkn1a、x型膠原、mmp-13、ihh和runx2的mrna表達顯著降低(p0.05);(2)safranin-o染色顯示,壓應力組軟骨細胞周圍的紅染程度比對照組顯著深;west-blot檢測顯示,壓應力組的ii型膠原蛋白量明顯高于對照組;(3)edu檢測顯示,壓應力組細胞的陽性率明顯高于對照組(p=0.0047);(4)免疫組織化學染色顯示,壓應力組細胞的ii型膠原染色陽性,i型膠原染色陰性。以上結果證實壓應力促進軟骨細胞的代謝和增殖,并抑制其分化。(4)壓應力使hdac4去磷酸化,并增加pp2a活性。(1)免疫共沉淀和west-blot檢測顯示,壓應力可使軟骨細胞內hdac4去磷酸化;(2)pp2a免疫沉淀磷酸酶檢測顯示,壓應力可增加pp2a活性。(5)岡田酸(okadaicacid,oa)抑制實驗。(1)oa阻止壓應力誘導的hdac4細胞核內移。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示,添加抑制劑oa后,軟骨細胞受到壓應力,hdac4仍然主要分布在細胞漿。west-blot分析顯示,添加抑制劑oa后,軟骨細胞即使受到壓應力,細胞漿和細胞核內的hdac4含量與未受壓應力的對照組相比變化也不明顯;(2)免疫共沉淀和west-blot檢測證實,加抑制劑oa后壓應力不能使hdac4去磷酸化;(3)pp2a免疫沉淀磷酸酶檢測顯示,加oa后壓應力不能增加pp2a活性;(4)rt-pcr檢測顯示,與壓應力組比較,oa+壓應力組中蛋白聚糖、ii型膠原、lk1和sox9的mrna表達顯著降低(p0.05),而cdkn1a、x型膠原、mmp-13、ihh和runx2的mrna表達顯著增高(p0.05);(5)應用hoechst33342/propidiumiodide(pi)雙染細胞凋亡檢測試劑盒觀察顯示,oa不誘導軟骨細胞死亡。結論:本實驗首次發(fā)現:(1)壓應力可促進hdac4由細胞漿進入細胞核;(2)hdac4進入細胞核后,可調節(jié)軟骨細胞基因表達,壓應力通過促進hdac4進入細胞核來調節(jié)軟骨細胞基因表達;(3)壓應力通過增加PP2A活性,去磷酸化HDAC4,來調節(jié)HDAC4進入細胞核。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R684

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