本文關(guān)鍵詞： DNA甲基化 DUSP9 胃癌 增值 JNK信號(hào)通路　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的和意義在2008年,全世界共新增胃癌約989600例,死亡約738000例,占癌癥總發(fā)生例數(shù)的約8%和癌癥引起總死亡人數(shù)的約10%。相關(guān)研究報(bào)道顯示,70%以上的胃癌新增和死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家。在中國,胃癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。眾多針對(duì)胃癌的研究表明,異常信號(hào)通路的活化是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素。絲裂原活化蛋白激酶-MAPK信號(hào)通路在其中發(fā)揮了重要的作用,其異常的活化參與了胃癌發(fā)生發(fā)展的全程。MAPK通路由一個(gè)高度保守的家族激酶模塊所構(gòu)成,傳遞來自細(xì)胞外的信號(hào),調(diào)控各種細(xì)胞的生物學(xué)過程,如細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡等。MAPK通過其保守特性的T-X-Y功能域中蘇氨酸和酪氨酸殘基的磷酸化從而被逐級(jí)活化。MAPK磷酸酶-MKPs是哺乳動(dòng)物MAPK信號(hào)通路活性的負(fù)調(diào)控蛋白。MKP家族是由10類來自不同亞群的具有催化活性的酶所構(gòu)成,其中包括半胱氨酸依賴的雙特異性蛋白磷酸酶家族-DUSP家族。雙重特異性磷酸酶9基因DUSP9,也被稱為有絲分裂原活化蛋白激酶磷酸酶4 (MKP4),是由Muda等在1997年首次發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行報(bào)道。DUSP9基因是蛋白酪氨酸磷酸酶家族(PTPS)成員之一。它由4個(gè)外顯子所構(gòu)成,其mRNA的大小長為8,884 bp,定位于X染色體的q28,編碼分子量為41.9kDa的蛋白。在包括胃癌在內(nèi)的眾多惡性腫瘤中,啟動(dòng)子區(qū)域DNA發(fā)生異常的高甲基化被認(rèn)為是抑癌基因失活的重要機(jī)制之一,抑癌基因的高甲基化主要發(fā)生在大多數(shù)腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期階段。上述啟動(dòng)子區(qū)域DNA發(fā)生異常高甲基化修飾的相關(guān)基因涉及細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞凋亡和血管生成等。已有研究表明,DUSP9在腎癌、鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào),在消化道腫瘤如大腸癌和肝細(xì)胞癌中其表達(dá)亦下調(diào)。DUSP9對(duì)鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌的抑癌能力在相關(guān)的小鼠模型中得到了證實(shí)。然而,截至目前為止,沒有研究對(duì)DUSP9在人胃癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行過檢測。此外,沒有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)DUSP9在胃癌中失活的分子機(jī)制進(jìn)行報(bào)道。本研究采用多例胃癌組織和正常胃黏膜組織。使用重亞硫酸鹽處理后的DNA進(jìn)行亞硫酸鹽測序PCR (BSP)分析。在胃癌細(xì)胞中通過慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)DUSP9后,胃癌細(xì)胞的增殖能力受到了明顯的抑制。材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)：胃癌細(xì)胞株MKN-1、TMK-1、MKN45、 BGC823、NCI-N87、 NUGC3、AGS和MKN-7細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞在37℃、5%CO2以及飽和濕度的條件生長傳代,生長狀態(tài)良好時(shí)用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR：使用TRIzol試劑提取胃癌細(xì)胞株和組織中的總RNA。我們使用PrimeScript RT Master Mix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄500 ng所提取的RNA獲得cDNA。實(shí)驗(yàn)所用引物由在線軟件Primer Bank自動(dòng)設(shè)計(jì)生成(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)。相關(guān)基因的表達(dá)計(jì)算方法為2-△△Ct。GAPDH作為內(nèi)參基因來校正各個(gè)基因的表達(dá)。每一次檢測均進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。亞硫酸氫鈉測序檢測胃癌組織DUSP9啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況：臨床標(biāo)本使用蛋白酶K過夜消化后第二天按照常規(guī)流程提取DNA。所提取的DNA使用德國Qiagen公司的EpiTect Bisulfite kit進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理。PCR產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠來確定PCR產(chǎn)物的唯一性。DUSP9亞硫酸氫鈉測序所用引物由在線軟件MethPrimer設(shè)計(jì)生成,產(chǎn)物長為138 BP,產(chǎn)物區(qū)中包含11個(gè)CpG位點(diǎn), 測序后結(jié)果分析使用NCBI在線BLAST頁面http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進(jìn)行序列比對(duì)。Western blot檢測：細(xì)胞裂解液是由包含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液制備而成,使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。添加好上樣緩沖液的蛋白裂解液在10% SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳,隨后轉(zhuǎn)PVDF膜并進(jìn)行封閉。一抗過夜孵育DUSP9、p21、CDK4、CDK6、CCND1及c-Jun抗體。第二天洗膜后二抗孵育1小時(shí),隨后上機(jī)曝光并采集圖像。皮下成瘤實(shí)驗(yàn)：選取BALB/c小鼠進(jìn)行皮下成瘤實(shí)驗(yàn)。收集感染LV-sh-DUSP9的MKN-1細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞,用無菌PBS重懸至細(xì)胞濃度為1×106／ml。取200uI(即含2×105個(gè)細(xì)胞)用無菌注射器注射于小鼠皮下,密切觀察腫瘤形成情況。每1-2d用游標(biāo)卡尺測量腫瘤大小,密切觀察并記錄兩側(cè)腫瘤生長情況及小鼠的生存時(shí)間。腫瘤生長一段時(shí)間后適時(shí)處死小鼠。載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染：野生型的真核表達(dá)載體由廣州賽哲生物科技有限公司所構(gòu)建,處理組質(zhì)粒(pEGFP-DUSP9)和對(duì)照組質(zhì)粒(pEGFP-C1)轉(zhuǎn)染使用的是Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。包含有G418的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞的篩選。建立穩(wěn)定過表達(dá)與沉默LV-sh-DUSP9/LV-DUSP9的MKN-1-胃癌細(xì)胞株：Lv-sh-DUSP9細(xì)胞株是由pLVTHM-GFP慢病毒RNAi表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建而成。慢病毒顆粒用于感染胃癌細(xì)胞株MKN-1。對(duì)照組和過表達(dá)DUSP9組的慢病毒顆粒購于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。按照廠家所提供的操作流程將慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)至MKN-1細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)DUSP9的LV-DUSP9細(xì)胞株。使用qPCR和Western blot方法檢測穩(wěn)定過表達(dá)／干擾DUSP9的效果。針對(duì)DUSP9設(shè)計(jì)的siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：針對(duì)DUSP9設(shè)計(jì)的siRNA及其對(duì)照均購置于廣州市銳博生物科技有限公司。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí),MKN-1細(xì)胞以30-50%的融合度接種于6孔板或96孔板。采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行siRNA的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,6孔板中每孔siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L,操作按TurboFect siRNA試劑說明書進(jìn)行。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)處理。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：接種200個(gè)MKN-1細(xì)胞到6孔板中,在鋪板時(shí)需保證細(xì)胞在培養(yǎng)皿中分散均勻,培養(yǎng)2周。2周后出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí),棄去培養(yǎng)基終止細(xì)胞培養(yǎng),甲醇固定后使用結(jié)晶紫進(jìn)行染色,在顯微鏡下計(jì)數(shù)形成克隆數(shù)目,計(jì)算方法為：細(xì)胞團(tuán)中細(xì)胞數(shù)目≥50個(gè)細(xì)胞為一個(gè)克隆。平板克隆形成率=形成克隆的數(shù)目／接種細(xì)胞數(shù)×100%。細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期分析：MTT實(shí)驗(yàn)用于檢測細(xì)胞增殖的能力：將5×103個(gè)MKN-1細(xì)胞接種于96孔板中,每組5孔,每孔的體積為200 μl,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組,分別培養(yǎng)24h、48h、72h和96h。在到達(dá)培養(yǎng)周期后,每孔加入濃度為5mg/ml的MTT 10 μ l,37℃培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng),小心吸盡孔內(nèi)的培養(yǎng)基,加入150 μ l二甲基亞砜后室溫孵育10min,使結(jié)晶物充分溶解,以空白對(duì)照為零進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,酶標(biāo)儀上選擇波長為490nm測定各孔吸光度值既OD值,以相對(duì)應(yīng)的OD比值表示細(xì)胞增殖能力的強(qiáng)弱。細(xì)胞周期分析：收集各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞,PBS離心后重懸2次,70%預(yù)冷乙醇4℃固定30min,PBS洗一次,按操作說明書加入含10μg/mL PI(碘化丙啶)的染色液,避光孵育15min進(jìn)行染色并經(jīng)尼龍膜濾過后,上流式細(xì)胞儀檢測。每一次檢測均進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果DUSP9在胃癌細(xì)胞系的表達(dá)下調(diào)。我們首先使用Q-PCR方法檢測胃癌細(xì)胞株中DUSP9 mRNA的表達(dá)。檢測結(jié)果表明,與正常胃黏膜組織比較,在7株胃癌細(xì)胞株中DUSP9的表達(dá)水平均發(fā)生了下調(diào)。接著我們檢測了在胃癌各個(gè)臨床分期中DUSP9的表達(dá)水平,我們發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期的加重,DUSP9 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào),提示我們DUSP9的表達(dá)缺失是胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的早期事件。在胃癌中DUSP9啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生異常的高甲基化。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),DUSP9啟動(dòng)子區(qū)的CpG島位于其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前1297 BP到其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后1104 BP。我們在30例胃癌組織和30例正常胃粘膜組織進(jìn)行亞硫酸鹽測序PCR檢測DUSP9啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況。亞硫酸鹽測序PCR檢測結(jié)果顯示,在正常胃粘膜中DUSP9啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化的平均水平為20.3%,相比之下,在胃癌中DUSP9啟動(dòng)子區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化水平明顯升高,達(dá)到了74.5%。為了進(jìn)一步證實(shí)DUSP9 CpG島異常甲基化是其表達(dá)下調(diào)的主要分子機(jī)制之一,我們使用不同濃度的去甲基化藥物5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理胃癌細(xì)胞株MKN-172小時(shí)之后,檢測DUSP9啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平及其mRNA的變化。去甲基化藥物5-氮雜-2’-脫氧胞苷處理胃癌細(xì)胞株MKN-1后,DUSP9啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平明顯下調(diào),同時(shí)伴隨著DUSP9 mRNA表達(dá)上調(diào)。這一結(jié)果提示在胃癌中DUSP9 CpG島異常甲基化是其表達(dá)下調(diào)的重要原因之一。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)DUSP9能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長。在胃癌細(xì)胞株MKN-1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DUSP9/對(duì)照質(zhì)粒之后,我們檢測了DUSP9對(duì)胃癌細(xì)胞生長的影響。MTT的檢測結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)染DUSP9質(zhì)粒后,胃癌細(xì)胞株MKN-1的生長率下調(diào)了52%,相反的是,在轉(zhuǎn)染Si-DUSP9后,胃癌細(xì)胞株MKN-1的生長率下調(diào)了74%。在克隆形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,我們發(fā)現(xiàn)感染了攜帶DUSP9慢病毒的MKN-1細(xì)胞的克隆形成能力要明顯弱于對(duì)照組。我們使用慢病毒感染MKN-1細(xì)胞使得DUSP9在細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá),之后我們使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的分布。相較于對(duì)照組,慢病毒感染的DUSP9過表達(dá)MKN-1細(xì)胞周期分布更多地是集中在G0/G1期而非S+G2/M期。相反的是,相較于對(duì)照組,慢病毒感染的sh-DUSP9過表達(dá)MKN-1細(xì)胞周期分布更多地是集中在S+G2/M期而非G0/G1期。上述結(jié)果提示,DUSP9對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用主要是通過對(duì)細(xì)胞周期G0/G1期的阻滯作用來實(shí)現(xiàn)。我們將感染了Lv-sh-DUSP9的MKN-1細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞注射到裸鼠皮下成瘤,兩周后統(tǒng)計(jì)兩組移植瘤的生長情況,注射了感染Lv-sh-DUSP9 MKN-1細(xì)胞的小鼠成瘤率明顯大于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在注射25天之后,注射感染了Lv-sh-DUSP9的MKN-1細(xì)胞小鼠瘤荷要明顯大于對(duì)照組,對(duì)照組腫瘤平均體積減小了60%。DUSP9通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)分子抑制細(xì)胞增殖。第二部分研究結(jié)果表明,感染了Lv-sh-DUSP9的MKN-1細(xì)胞周期分布更多地是集中在S+G2/M期而非G0/G1期,提示DUSP9對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用可能是由于誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期所引起。為了進(jìn)一步闡明DUSP9抑制細(xì)胞增殖過程中所涉及的分子機(jī)制,我們在MKN-1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DUSP9質(zhì)粒之后使用Q-PCR方法檢測了細(xì)胞周期相關(guān)因子CCND1、CDK6和p21基因mRNA表達(dá)變化情況。我們發(fā)現(xiàn)MKN-1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DUSP9質(zhì)粒之后,CCND1 mRNA在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后下調(diào)至原來的0.81倍,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后下調(diào)至原來的0.35倍,這一下調(diào)的趨勢一直延續(xù)到轉(zhuǎn)染后72小時(shí)。在對(duì)CDK4和CDK6基因mRNA的表達(dá)水平變化中也觀察到相類似的情況。相反的是,在MKN-1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Si-DUSP9質(zhì)粒之后細(xì)胞周期相關(guān)因子CCND1、CDK6和p21基因mRNA表達(dá)出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)。使用Western Blot方法檢測了感染LV-DUSP9慢病毒的MKN-1細(xì)胞及對(duì)照組中細(xì)胞周期相關(guān)基因CCND1、c-Jun、CDK4、CDK6和p21蛋白表達(dá)變化情況。我們發(fā)現(xiàn),在感染了LV-DUSP9慢病毒的MKN-1細(xì)胞中,相較于對(duì)照組c-Jun和CCND1蛋白的表達(dá)水平顯著下調(diào),我們同時(shí)也觀察到CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)下調(diào),而在感染了LV-DUSP9慢病毒的MKN-1細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)上調(diào)。相反的是,在感染了LV-sh-DUSP9慢病毒的MKN-1細(xì)胞中,相較于對(duì)照組c-Jun和CCND1蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào),我們同時(shí)也觀察到CDK4和CDK6蛋白的表達(dá)上調(diào),而在感染了LV-sh-DUSP9慢病毒的MKN-1細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)卻發(fā)生了下調(diào)。為了進(jìn)一步闡明DUSP9調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)過程中所涉及的重要信號(hào)通路,我們對(duì)感染LV-DUSP9/LV-sh-DUSP9慢病毒的MKN-1細(xì)胞添加JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125后,使用Western Blot方法檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因CCND1、c-Jun、CDK4、CDK6和p21蛋白表達(dá)變化情況。在添加JNK抑制劑之后,DUSP9對(duì)MKN-1細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)基因CCND1、c-Jun、CDK4、CDK6和p21蛋白表達(dá)的調(diào)控作用要明顯降低甚至消失,提示DUSP9對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控與MAPK/JNK信號(hào)通路密切相關(guān)。結(jié)論總之,在人類胃癌中DUSP9基因其啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生高甲基化而導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào),DUSP9基因能夠通過MAPK/JNK信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn),過表達(dá)DUSP9能夠顯著下調(diào)JNK信號(hào)通路的活性,而DUSP9對(duì)MKN-1細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)基因CCND1、c-Jun、CDK4、CDK6和p21蛋白表達(dá)的調(diào)控作用能夠被JNK信號(hào)通路抑制劑SP600125所阻斷。本研究提示,增加DUSP9表達(dá)或活性的干預(yù)治療可能活化胃癌細(xì)胞內(nèi)的抗增殖信號(hào)通路從而達(dá)到治療的目的。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.2

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本文編號(hào)：1500624