本文關(guān)鍵詞： PCV2 免疫增強(qiáng)劑 基因工程苗 角鯊?fù)?PoIFN-γ　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirus2,PCV2)是一種豬群易感染的常見病原體,與多種豬群傳染性疾病的爆發(fā)流行有關(guān)。最為常見的疾病是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS),為有效控制及消滅PCV2的爆發(fā)流行,各國學(xué)者均致力于PCV2有效疫苗的研發(fā)。PCV2 Cap蛋白是目前研發(fā)PCV2基因工程疫苗的首選靶抗原。另有研究表明,免疫增強(qiáng)劑是一類免疫促進(jìn)劑及免疫刺激劑,主要功能是增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤、抗感染、糾正免疫缺陷能;免疫增強(qiáng)劑具有激活體內(nèi)多種免疫活性細(xì)胞,增強(qiáng)機(jī)體特異性及非特異性免疫功能,還能發(fā)揮佐劑作用,強(qiáng)化與之配合使用的抗原免疫原性,從而加速誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。目前免疫增強(qiáng)劑種類很多。本研究對(duì)七種免疫增強(qiáng)劑進(jìn)行篩選,包括黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、鹽酸左旋咪唑、角鯊?fù)椤oly(I:C),Po-IFN-y蛋白和Po-GM-CSF蛋白,目的是篩選對(duì)本實(shí)驗(yàn)室制備的PCV2-Cap蛋白疫苗有最佳增強(qiáng)效果的免疫增強(qiáng)劑。1.黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、鹽酸左旋咪唑、角鯊?fù)�、Poly(I:C)對(duì)PCV2基因工程疫苗的免疫增強(qiáng)研究為探究免疫增強(qiáng)劑對(duì)PCV2基因工程疫苗的免疫增強(qiáng)作用,本研究制備了黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、鹽酸左旋咪唑、角鯊?fù)�、Poly(I:C)等5種免疫增強(qiáng)劑+PCV2Cap疫苗。制備方法均按PCV2-Cap蛋白:Gel 01佐劑:免疫增強(qiáng)劑體積比為75:20:5來配置疫苗。采用腹腔注射方式免疫小鼠。21 d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn),以鑒定5種免疫增強(qiáng)劑的免疫保護(hù)效力。采用間接ELISA方法測(cè)定免疫21 d血清PCV2特異性IgG抗體水平,結(jié)果表明,Poly(I:C)與角鯊?fù)閮煞N增強(qiáng)劑能誘導(dǎo)疫苗產(chǎn)生更高水平的PCV2特異性IgG抗體,顯著提高PCV2疫苗的免疫原性。CUSABIO試劑盒檢測(cè)鼠免疫后21 d小鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)Con A刺激后上清當(dāng)中IL-4、IL-6、IFN-γ細(xì)胞因子濃度,結(jié)果表明:角鯊?fù)槟茱@著促進(jìn)PCV2Cap疫苗誘導(dǎo)小鼠分泌IL-6和IFN-γ。Poly(I:C)僅有輕微促進(jìn)作用。PCV2攻毒后21 d,采用熒光定量PCR檢測(cè)PCV2病毒血癥及脾臟的PCV2載量,結(jié)果表明:角鯊?fù)槟茌o助PCV2-Cap疫苗減輕攻毒后PCV2的病毒血癥及降低脾臟病毒攜帶水平。因此,角鯊?fù)榕cPCV2-Cap蛋白混合免疫能顯著增強(qiáng)PCV2-Cap疫苗的免疫保護(hù)作用;Ploy(I:C)雖然也能提高該疫苗的細(xì)胞免疫水平,但對(duì)病毒血癥及脾臟病毒攜帶量的控制不如角鯊?fù)樽饔妹黠@。2.黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、鹽酸左旋咪唑、角鯊?fù)�、Poly(I:C)組成的復(fù)方對(duì)PCV2基因工程疫苗的免疫增強(qiáng)研究為探究復(fù)方免疫增強(qiáng)劑對(duì)PCV2-Cap蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)作用,本研究根據(jù)免疫增強(qiáng)機(jī)制和搭配禁忌,從黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、鹽酸左旋咪唑、角鯊?fù)椤oly(I:C)5種免疫增強(qiáng)劑中挑選2到4種組合成6組復(fù)方,構(gòu)成復(fù)方免疫增強(qiáng)劑+PCV2 Cap疫苗。制備方法均按PCV2-Cap疫苗:Gel 01佐劑:免疫增強(qiáng)劑體積比為75:20:5來配置疫苗。采用腹腔注射方式免疫小鼠。21 d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn),以鑒定6種復(fù)方免疫增強(qiáng)劑的免疫保護(hù)效果。采用間接ELISA方法測(cè)定免疫21 d血清PCV2特異性IgG抗體水平。CUSABIO試劑盒檢測(cè)鼠免疫后21 d小鼠血清當(dāng)中IL-4、IL-6、IFN-γ細(xì)胞因子濃度。PCV2攻毒后21天,采用熒光定量PCR檢測(cè)PCV2病毒血癥。綜合結(jié)果表明:黃芪多糖+鹽酸左旋咪唑+Poly(I:C);黃芪多糖+鹽酸左旋咪唑+角鯊?fù)?Poly(I:C);黃芪多糖+Poly(I:C)三組復(fù)方增強(qiáng)劑能輔助PCV2-Cap疫苗減輕攻毒后PCV2病毒血癥。因此,這三組復(fù)方免疫增強(qiáng)劑和PCV2-Cap蛋白混合免疫能顯著增強(qiáng)PCV2-Cap疫苗的免疫保護(hù)作用,三組中,黃芪多糖+Poly(I:C)組免疫增強(qiáng)效果最佳;其余三組復(fù)方疫苗雖然也能提高體液或者細(xì)胞免疫水平,但對(duì)病毒血癥的緩解不如這三組作用明顯。3.豬IFN-y與豬GM-CSF的表達(dá)和純化通過PCR進(jìn)行目的基因擴(kuò)增、雙酶切、與載體連接、轉(zhuǎn)化、鑒定,制備PoIFN-γ-pCold I-Fh8和PoGM-CSF-pCold I-Fh8重組菌液;最終進(jìn)一步對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白表達(dá),并且優(yōu)化IPTG誘導(dǎo)濃度、時(shí)間,提高蛋白表達(dá)效率;最終,豬IFN-γ以包涵體形式表達(dá),而豬GM-CSF大部分以可溶性形式表達(dá)。最后,采用GE蛋白純化柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化,獲得濃度分別為1.6 mg/ml和2.6 mg/ml的豬IFN-y、豬GM-CSF兩種細(xì)胞因子類重組蛋白。為進(jìn)一步研究豬IFN-γ、GM-CSF兩種細(xì)胞因子類蛋白對(duì)PCV2-Cap蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)作用提供基礎(chǔ)。4.豬IFN-]與豬GM-CSF對(duì)PCV2-Cap基因工程疫苗的免疫增強(qiáng)作用研究為探究PoIFN-γ、PoGM-CSF兩種重組蛋白對(duì)PCV2-Cap蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)作用,將研制的2種重組蛋白與PCV2 Cap蛋白疫苗混合,分別免疫小鼠,21 d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。采用間接ELISA方法測(cè)定免疫21 d血清PCV2特異性Ig G抗體水平,結(jié)果表明,PoIFN--γ重組蛋白能顯著提高PCV2-Cap疫苗免疫產(chǎn)生的血清特異性IgG抗體水平(p0.05);PoGM-CSF重組蛋白未觀察到此類增強(qiáng)效果(p0.05)。采用SYBR熒光定量PCR法檢測(cè)鼠免疫后21 d脾臟淋巴細(xì)胞IL-4、IL-6、IFN-γ細(xì)胞因子基因mRNA表達(dá)水平,結(jié)果表明,PoIFN-γ重組蛋白能顯著提高疫苗免疫后脾臟細(xì)胞IL-4、IFN-γ的m RNA表達(dá)水平。PCV2攻毒后21d,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PCV2病毒血癥及脾臟PCV2病毒載量,結(jié)果表明,PoIFN-γ重組蛋白能顯著減輕攻毒后PCV2病毒血癥,對(duì)PCV2病毒有明顯抑制作用,并且能有效降低脾臟PCV2病毒載量。因此,PoIFN-y重組蛋白能顯著增強(qiáng)PCV2-Cap疫苗的免疫保護(hù)作用,本研究為進(jìn)一步測(cè)定其在豬體上的免疫增強(qiáng)作用奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:A new type of vaccine against PCV2 - Cap protein has been prepared by immunizing mice by intraperitoneal injection . Its main function is to enhance the anti - tumor , anti - infection and anti - immune deficiency of PCV2 . The immune enhancement of PCV2 - Cap vaccine was studied by means of indirect ELISA . The recombinant protein of porcine IFN - 緯 and GM - CSF could be used to enhance the immune function of PCV2 - Cap protein vaccine . The results showed that the recombinant protein of PoIFN - 緯 could significantly improve the expression level of IL - 4 and IFN - 緯 in spleen cells after vaccination .

【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S859.7

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本文編號(hào)：1500593