本文關(guān)鍵詞： 大腸桿菌 假基因 口服疫苗 小鼠 豬　出處：《東北農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一種主要危害新生仔豬的急性傳染病,主要通過黏附素和腸毒素引起仔豬劇烈腹瀉。腹瀉的仔豬往往因沒得到有效預(yù)防而死亡,從而給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示:ETEC的耐藥性在不斷提高,而其黏附素的檢出率卻在下降,所以繼續(xù)使用傳統(tǒng)藥物以及針對黏附素的疫苗進(jìn)行防治已不合時(shí)宜,需要一種有效的疫苗盡快出現(xiàn)。為明確嵌合基因在具有天然佐劑功能的不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin-1,LT-1)骨架上的插入位置,先制備了一株針對LT-1,具有中和活性的特異性單克隆抗體,該單抗能有效的阻斷LT-1毒素與GM1受體的結(jié)合。通過生物信息學(xué)軟件ABCpred預(yù)測,然后用單抗對LTB進(jìn)行分段篩選,鑒定出與GM1受體結(jié)合的肽段MBP-LTB-7(61QKKAIERMKDTLRITY76)。以此為依據(jù),在不影響段肽MBP-LTB-7結(jié)構(gòu)的位置插入外源基因。本研究以大腸桿菌K12基因序列為參照,使用在線服務(wù)軟件ABCpred預(yù)測出6個(gè)可插入外源基因的假基因位置,分別是yaiT、yai X、yge O和yge Q、wbb L、ins N、eaeH+和ykg A。進(jìn)一步經(jīng)PCR鑒定發(fā)現(xiàn)我們分離并改造的野生E.coli O142:△STa菌株中yai T和yai X兩個(gè)假基因位置可作為攜帶外源基因的插入點(diǎn)。分別以假基因yai T和yai X為模板擴(kuò)增出假基因yai T和yaiX的左右同源臂,連入pDOC-K質(zhì)粒上,構(gòu)建PRPL-Kil雙向篩選平臺(tái),然后將平臺(tái)質(zhì)粒與p ACBSCE質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化減毒E.coli O142:△STa中。經(jīng)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)使其中的pACBSCE質(zhì)粒表達(dá)I-Sce I切割酶和Red重組酶,含有假基因yaiT和yai X同源臂的PRPL-Kil操縱子分別被切下后與E.coli O142:△STa中的yaiT和yai X假基因位置發(fā)生同源重組,構(gòu)建成O142(yai T::PRPL-Kil)和O142(yai X::PRPL-Kil)兩株雙向篩選平臺(tái)。經(jīng)鑒定當(dāng)溫度升高到43°C時(shí)平臺(tái)中溫敏開關(guān)打開,kill基因可殺死菌體起到反向篩選效果,表明平臺(tái)具有相應(yīng)生物活性。通過SOE-PCR構(gòu)建嵌合類毒素基因,先將致弱的STaA13Q連在致弱的LTR192G操縱子B亞基后端,再利用SOE-PCR的方法將STb和LT天然轉(zhuǎn)錄終止子連到LT192-STa13后,獲得LT192-STa13-STb操縱子。將LTA分為LTA1和LTA2兩段,再將STa13-STb從LT192-STa13-STb上克隆下來,與LTA1相連獲得LTA1-(STa13-STb),最后再將LTA2-LTB-STa13-STb與其進(jìn)行組裝獲嵌合基因LTA1-(STa-STb)-LTA2-LTB-(STa-STb)操縱子。在其兩端分別連上假基因yaiT和yai X的左右同源臂,構(gòu)建pDOC-C同源重組系統(tǒng),按照建立平臺(tái)時(shí)的方法,用LTA1-(STa-STb)-LTA2-LTB-(STa-STb)操縱子去替換插在不同假基因位置上的雙向篩選平臺(tái),得到重組E.coli ER-T和ER-X。通過毒性檢測、消化道環(huán)境模擬實(shí)驗(yàn)、口服安全性檢測、生長曲線測定、遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、菌毛生長能力鑒定、及腸道定植能力測定,結(jié)果顯示:重組E.coli ER-T和ER-X安全、穩(wěn)定,可在腸道定植。進(jìn)一步以重組E.coli ER-T和ER-X對BALB/c小鼠進(jìn)行口服免疫,檢測各時(shí)間點(diǎn)小鼠特異性Ig G及Ig A抗體水平,結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組小鼠首次免疫后7-21d,在其血清中均可檢測到抗LTA(P0.05)、LTB(P0.05)、STa(P0.05)、STb(P0.05)、F41(P0.05)的IgG抗體。各實(shí)驗(yàn)組小鼠免疫后7-28d在其糞便中可檢測出抗LTA(P0.05)、LTB(P0.05)、STa(P0.05)、STb(P0.05)、F41(P0.05)的Ig A抗體。首次免疫后42d在小鼠乳汁、脾臟、腸黏液、腸系膜淋巴結(jié)中仍能檢測到抗LTA(P0.05)、LTB(P0.05)、STa(P0.05)、STb(P0.05)、F41(P0.05)的Ig G和Ig A抗體;在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組脾細(xì)胞經(jīng)STa毒素、LT192-STa13重組蛋白、STb毒素、LT192-STb重組蛋白、LT毒素刺激后增殖效果明顯好于對照組(P0.05);各組脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4檢測結(jié)果顯示:免疫組小鼠IFN-γ水平有所上升但沒有IL-4上升明顯。體外中和實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)中和試驗(yàn)結(jié)果顯示:口服免疫后的小鼠血清、脾細(xì)胞裂解液、腸粘液、腸系膜淋巴細(xì)胞裂解液對腸毒素具有中和作用。乳鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示:獲得母源抗體的乳鼠具有抵抗腸毒素侵襲的能力。重組E.coli ER-T和ER-X免疫仔豬和妊娠母豬后進(jìn)行Ig G及Ig A抗體檢測、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞因子檢測、體內(nèi)中和以及體外中和實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果的趨勢與小鼠基本相似。攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中,免疫組腸絨毛的各項(xiàng)檢測數(shù)據(jù)優(yōu)于對照組仔豬,兩者差異顯著(P0.05),表明免疫后仔豬可以抵抗腸毒素攻擊。本研究為增強(qiáng)大腸桿菌重組活載體疫苗的免疫效果,通過表位篩選確定了LT1與GM1受體的結(jié)合域,構(gòu)建了可以穩(wěn)定表達(dá)嵌合腸毒素基因的重組減毒E.coli ER-A和ER-B,探索了不同假基因攜帶外源基因的差異,為重組減毒大腸桿菌口服疫苗研究提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1496377