本文關鍵詞： 玉米 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 ZmWRKY17 鹽脅迫 轉(zhuǎn)錄組測序　出處：《安徽農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：玉米是世界范圍內(nèi)重要的糧食作物之一,是公認的黃金食物。但是其生長發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)受到干旱、鹽漬等非生物脅迫的嚴重影響,挖掘抗逆相關基因,研究其逆境應答機制,培育抗逆性較強的玉米新品種是應對逆境脅迫,提高玉米產(chǎn)量的最有效途徑。近些年的研究表明,轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育及脅迫應答方面起著非常重要的作用。過量表達一個特定的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游多個抗逆相關基因的表達,從而達到對作物進行綜合改良的效果。WRKY蛋白家族是目前研究比較熱門的逆境相關轉(zhuǎn)錄因子家族之一,其家族成員尤其是Ⅱd亞族成員廣泛參與了植物對各種脅迫的應答反應、生長發(fā)育、代謝調(diào)控等一系列生理活動。本研究首先對玉米中Ⅱd亞族WRKY基因的誘導表達模式、轉(zhuǎn)錄活性、以及鈣調(diào)素結合特性等分子特征進行了系統(tǒng)分析。從玉米中克隆了脅迫相關關鍵基因ZmWRKY17,通過過量表達技術對ZmWRKY17在轉(zhuǎn)基因植物中的抗逆功能進行了驗證,并利用轉(zhuǎn)錄組測序技術對其作用機制進行了初步探索,獲得了如下主要結果:1.對玉米中12個Ⅱd亞族WRKY基因的分子特性進行了分析。研究發(fā)現(xiàn),玉米中7個Ⅱd亞族WRKY基因的表達均受到干旱和高鹽脅迫的誘導�？寺〉玫狡渲�6個基因。酵母轉(zhuǎn)錄活性分析表明這6個Ⅱd亞族WRKY基因在酵母中均不具有轉(zhuǎn)錄激活能力。酵母雙雜交實驗表明,6個Ⅱd亞族WRKY蛋白均能夠與鈣調(diào)素發(fā)生相互作用。2.根據(jù)進化關系和誘導表達模式分析結果,選取了ZmWRKY17作為關鍵基因進行下一步的功能分析。序列分析顯示,ZmWRKY17基因cDNA全長為996bp,編碼331個氨基酸,與玉米B73數(shù)據(jù)庫中公布的序列完全一致。通過熒光定量PCR進一步對ZmWRKY17的表達特性進行分析,發(fā)現(xiàn)該基因的表達還受到外源ABA的誘導。組織表達模式分析顯示,ZmWRKY17在根、莖、葉、花絲、雄穗、果穗和胚7個組織中均有表達,其中以雄穗中的表達水平最高。亞細胞定位結果顯示,ZmWRKY17-GFP的融合表達蛋白定位在細胞核中。酵母單雜交實驗表明,ZmWRKY17能夠與W-box序列發(fā)生特異性的結合。3.構建了ZmWRKY17過量表達載體,并通過農(nóng)桿菌介導的方法獲得了多個擬南芥轉(zhuǎn)基因株系。對轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進行了抗鹽表型鑒定實驗,結果表明:在高鹽脅迫處理后,轉(zhuǎn)基因植株的相對電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量均明顯高于野生型植株,說明過量表達ZmWRKY17提高了轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的敏感性。4.ABA敏感性實驗顯示ZmWRKY17的過量表達降低了轉(zhuǎn)基因植株對外源ABA的敏感性。另外,在外施ABA合成抑制劑的情況下,轉(zhuǎn)基因株系的種子在高鹽脅迫下的萌發(fā)受強烈抑制的表型得到恢復。5.對ZmWRKY17作用機制進行了初步探索,通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)Ω啕}脅迫處理前后的擬南芥植株(包括野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株)進行了基因差異表達分析。結果發(fā)現(xiàn),野生型擬南芥在高鹽處理后共獲得316個差異表達基因,轉(zhuǎn)基因株系中共獲得334個差異表達基因。通過對RD29B、RAB18、KIN1、DREB1F、bHLH92等多個脅迫應答功能基因的表達變化分析發(fā)現(xiàn),在高鹽條件下,這些抗逆功能基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達上調(diào)變化程度顯著低于野生型植株。而ABA合成相關基因NCED5在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達上調(diào)變化程度顯著高于野生型植株。綜上所述,本研究首先對玉米中Ⅱd亞族WRKY基因的分子特性進行了分析。根據(jù)誘導表達模式、進化關系和序列特征等分析結果,選取了ZmWRKY17作為關鍵基因進行下一步的功能研究。過量表達該基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株對高鹽脅迫的敏感性,同時,轉(zhuǎn)基因植株對ABA的敏感性降低。轉(zhuǎn)錄組測序結果證實野生型植株和轉(zhuǎn)基因株系在高鹽處理后,一些脅迫/ABA應答功能基因表達水平發(fā)生了明顯變化。以上結果表明ZmWRKY17基因主要通過依賴于ABA信號傳導途徑調(diào)節(jié)抗逆功能基因的表達,從而負調(diào)控對高鹽脅迫的應答反應。
[Abstract]:In recent years , the expression of ZmWRKY17 gene in transgenic plants has been studied . In conclusion , the expression of the gene NCED5 in transgenic Arabidopsis was significantly lower than that of wild - type plants under high salt conditions .

【學位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S513;Q943.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

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2 張春蘭;秦孜娟;王桂芝;紀志賓;王建民;;轉(zhuǎn)錄組與RNA-Seq技術[J];生物技術通報;2012年12期

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1 李光雷;棉花GhWRKY11基因的克隆及功能驗證[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

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