發(fā)布時(shí)間：2018-02-01 21:09

  本文關(guān)鍵詞： 玉米 WRKY轉(zhuǎn)錄因子 ZmWRKY17 鹽脅迫 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序　出處：《安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：玉米是世界范圍內(nèi)重要的糧食作物之一,是公認(rèn)的黃金食物。但是其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)受到干旱、鹽漬等非生物脅迫的嚴(yán)重影響,挖掘抗逆相關(guān)基因,研究其逆境應(yīng)答機(jī)制,培育抗逆性較強(qiáng)的玉米新品種是應(yīng)對(duì)逆境脅迫,提高玉米產(chǎn)量的最有效途徑。近些年的研究表明,轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答方面起著非常重要的作用。過(guò)量表達(dá)一個(gè)特定的轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控下游多個(gè)抗逆相關(guān)基因的表達(dá),從而達(dá)到對(duì)作物進(jìn)行綜合改良的效果。WRKY蛋白家族是目前研究比較熱門(mén)的逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子家族之一,其家族成員尤其是Ⅱd亞族成員廣泛參與了植物對(duì)各種脅迫的應(yīng)答反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控等一系列生理活動(dòng)。本研究首先對(duì)玉米中Ⅱd亞族WRKY基因的誘導(dǎo)表達(dá)模式、轉(zhuǎn)錄活性、以及鈣調(diào)素結(jié)合特性等分子特征進(jìn)行了系統(tǒng)分析。從玉米中克隆了脅迫相關(guān)關(guān)鍵基因ZmWRKY17,通過(guò)過(guò)量表達(dá)技術(shù)對(duì)ZmWRKY17在轉(zhuǎn)基因植物中的抗逆功能進(jìn)行了驗(yàn)證,并利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索,獲得了如下主要結(jié)果:1.對(duì)玉米中12個(gè)Ⅱd亞族WRKY基因的分子特性進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn),玉米中7個(gè)Ⅱd亞族WRKY基因的表達(dá)均受到干旱和高鹽脅迫的誘導(dǎo)�？寺〉玫狡渲�6個(gè)基因。酵母轉(zhuǎn)錄活性分析表明這6個(gè)Ⅱd亞族WRKY基因在酵母中均不具有轉(zhuǎn)錄激活能力。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明,6個(gè)Ⅱd亞族WRKY蛋白均能夠與鈣調(diào)素發(fā)生相互作用。2.根據(jù)進(jìn)化關(guān)系和誘導(dǎo)表達(dá)模式分析結(jié)果,選取了ZmWRKY17作為關(guān)鍵基因進(jìn)行下一步的功能分析。序列分析顯示,ZmWRKY17基因cDNA全長(zhǎng)為996bp,編碼331個(gè)氨基酸,與玉米B73數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的序列完全一致。通過(guò)熒光定量PCR進(jìn)一步對(duì)ZmWRKY17的表達(dá)特性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)還受到外源ABA的誘導(dǎo)。組織表達(dá)模式分析顯示,ZmWRKY17在根、莖、葉、花絲、雄穗、果穗和胚7個(gè)組織中均有表達(dá),其中以雄穗中的表達(dá)水平最高。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,ZmWRKY17-GFP的融合表達(dá)蛋白定位在細(xì)胞核中。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)表明,ZmWRKY17能夠與W-box序列發(fā)生特異性的結(jié)合。3.構(gòu)建了ZmWRKY17過(guò)量表達(dá)載體,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了多個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行了抗鹽表型鑒定實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:在高鹽脅迫處理后,轉(zhuǎn)基因植株的相對(duì)電解質(zhì)滲透率和丙二醛含量均明顯高于野生型植株,說(shuō)明過(guò)量表達(dá)ZmWRKY17提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽脅迫的敏感性。4.ABA敏感性實(shí)驗(yàn)顯示ZmWRKY17的過(guò)量表達(dá)降低了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)外源ABA的敏感性。另外,在外施ABA合成抑制劑的情況下,轉(zhuǎn)基因株系的種子在高鹽脅迫下的萌發(fā)受強(qiáng)烈抑制的表型得到恢復(fù)。5.對(duì)ZmWRKY17作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)Ω啕}脅迫處理前后的擬南芥植株(包括野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株)進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),野生型擬南芥在高鹽處理后共獲得316個(gè)差異表達(dá)基因,轉(zhuǎn)基因株系中共獲得334個(gè)差異表達(dá)基因。通過(guò)對(duì)RD29B、RAB18、KIN1、DREB1F、bHLH92等多個(gè)脅迫應(yīng)答功能基因的表達(dá)變化分析發(fā)現(xiàn),在高鹽條件下,這些抗逆功能基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)上調(diào)變化程度顯著低于野生型植株。而ABA合成相關(guān)基因NCED5在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)上調(diào)變化程度顯著高于野生型植株。綜上所述,本研究首先對(duì)玉米中Ⅱd亞族WRKY基因的分子特性進(jìn)行了分析。根據(jù)誘導(dǎo)表達(dá)模式、進(jìn)化關(guān)系和序列特征等分析結(jié)果,選取了ZmWRKY17作為關(guān)鍵基因進(jìn)行下一步的功能研究。過(guò)量表達(dá)該基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽脅迫的敏感性,同時(shí),轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ABA的敏感性降低。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果證實(shí)野生型植株和轉(zhuǎn)基因株系在高鹽處理后,一些脅迫/ABA應(yīng)答功能基因表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化。以上結(jié)果表明ZmWRKY17基因主要通過(guò)依賴(lài)于ABA信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)抗逆功能基因的表達(dá),從而負(fù)調(diào)控對(duì)高鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。
[Abstract]:In recent years , the expression of ZmWRKY17 gene in transgenic plants has been studied . In conclusion , the expression of the gene NCED5 in transgenic Arabidopsis was significantly lower than that of wild - type plants under high salt conditions .

【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S513;Q943.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1482881