本文關(guān)鍵詞： 抗增殖蛋白 心肌纖維化 凋亡 糖尿病心肌病　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是指發(fā)病于糖尿病患者中,不能用高血壓、冠狀動脈粥樣硬化、心臟瓣膜病以及其他心臟病變來解釋的心肌疾病。研究發(fā)現(xiàn),心血管疾病的發(fā)病率和死亡率在糖尿病患者中均占首位。即使沒有眾所周知的危險因素如冠狀動脈疾病和高血壓,糖尿病患者罹患心肌病的發(fā)展風(fēng)險也會增加。非侵入性研究顯示,左心室收縮、舒張功能不全以及左心室肥大均可在糖尿病心肌病,尤其是在合并高血壓和冠狀動脈微循環(huán)障礙的患者中觀察到。當(dāng)糖尿病患者出現(xiàn)左心室舒張功能障礙后,會發(fā)生膠原蛋白結(jié)構(gòu)的繼發(fā)改變,特別是膠原蛋白交聯(lián)以及晚期糖基化終末產(chǎn)物的增加�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)是心肌重構(gòu)過程中能夠起關(guān)鍵作用的一種蛋白酶,與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of matrix metal loproteinase, TIMP)維持著微妙的平衡。在糖尿病心肌病中,這種平衡被打破,造成膠原的異常沉積。過往研究發(fā)現(xiàn),MMP2可以激發(fā)大鼠心肌成纖維細胞中膠原蛋白Ⅰ(collagen Ⅰ, COL Ⅰ)的表達,且MMP的表達與心肌纖維化的嚴重程度相關(guān)。細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)(主要是膠原蛋白Ⅰ,膠原蛋白Ⅲ(collagen Ⅲ, COL Ⅲ))的過度生產(chǎn),可以改變心臟的結(jié)構(gòu)和功能,是糖尿病心肌病最重要的病理特征之一。心肌細胞持續(xù)凋亡是造成心肌肥厚和纖維化的另外一個重要標(biāo)志,抑制心肌細胞凋亡可以有效阻止糖尿病心肌病的進展。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的主要因素。在高血糖環(huán)境下,心肌細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加,并且能夠釋放一系列細胞因子及活性氧產(chǎn)物,觸發(fā)心肌細胞死亡信號通路。另外,氧化應(yīng)激和胰島素抵抗以及胰島素分泌受損也密切相關(guān)。抗增殖蛋白(Prohibitin, PHB)是一種高度保守的多效性蛋白質(zhì),廣泛表達于真核細胞中,如線粒體、細胞核和細胞膜等。它涉及多種細胞功能包括增殖、凋亡、腫瘤抑制、轉(zhuǎn)錄和線粒體蛋白質(zhì)折疊,其最有特征性的功能是作為線粒體的伴侶蛋白。研究表明,PHB缺乏可導(dǎo)致線粒體膜去極化并促進活性氧的生成繼而誘發(fā)凋亡,而PHB過表達可以通過緩解氧化應(yīng)激引起的損傷來降低心肌細胞線粒體的凋亡水平。另外,Supale等報道PHB基因過表達與肝臟及腎臟的纖維化水平呈負相關(guān),并能提高H2O2刺激下新生鼠心肌原代細胞的存活率。糖尿病心肌病的發(fā)生涉及多種多樣的分子機制,其中經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Akt信號通路與PHB密切相關(guān),并能夠被高糖激活,參與心肌細胞肥大、凋亡和心肌細胞因子介導(dǎo)的炎癥。以上分析提示我們,PHB有可能在糖尿病心肌病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。因此,本研究將在大鼠2型糖尿病模型的基礎(chǔ)上,研究PHB基因在糖尿病心肌病中的作用及其潛在的機制。研究目的1、研究PHB在大鼠糖尿病心肌病中的作用以及潛在機制。2、研究PHB對高糖誘導(dǎo)的新生大鼠原代成纖維細胞異常增殖,異常膠原分泌的影響。3、研究PHB對高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞凋亡的影響。研究方法第一部分1.慢病毒構(gòu)建構(gòu)建攜帶有大鼠抗增殖蛋白基因的慢病毒載體(Lv-phb+),同時設(shè)計攜帶有綠色熒光蛋白的慢病毒空載體(Lv-vehicle)作為陰性對照。2.實驗用大鼠分組及處理60只雄性健康Sprague-Dawley (SD)大鼠(120-140 g)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,進行葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)并被隨機分以下成四個實驗組：(1)正常對照組(Con組)；(2)單純糖尿病組(DM組)；(3)糖尿病+陰性對照組(DM+Lv-vehicle組)；(4)糖尿病+PHB過表達組(DM+Lv-phb’組)。正常對照組大鼠喂以普通基礎(chǔ)飼料,其成分主要為：粗蛋白20%,粗脂肪3%,粗纖維3%,其他74%。其余三組糖尿病大鼠喂以高脂飼料,其成分主要為：脂肪34.5%,蛋白質(zhì)17.5%,碳水化合物48%。4周后,進行葡萄糖耐量實驗(IPGTT)及胰島素耐量實驗(intraperitoneal insulin tolerance test, IPITT),對于出現(xiàn)胰島素抵抗的DM組大鼠,腹腔注射27.5mg/kg鏈脲佐菌(Streptozotocin, STZ), Con組大鼠腹腔注射同等劑量枸櫞酸鈉緩沖液。周后,檢測DM組大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG)水平,連續(xù)兩次空腹血糖水平11. lmmol/L被認為造模成功。在糖尿病誘導(dǎo)后12周,兩組糖尿病的大鼠分別通過頸靜脈靜脈注射5×107UT.50μ L攜帶PHB cDNA-GFP的慢病毒載體(中國,上海GenePharma)或同樣體積的慢病毒空載體(中國,上海GenePharma)。在糖尿病誘導(dǎo)后16周,再次進行IPGTT及胰島素耐量實驗IPITT,并于顯微鏡下觀察心肌組織中GFP的陽性率分析病毒轉(zhuǎn)染效率。對老鼠均進行安樂死處理,同時留取血液和組織標(biāo)本。3.生化指標(biāo)的測定每4周大鼠禁食12小時后,內(nèi)眥靜脈取血,離心留取血清后檢測血清甘油三酯(Triglycercide, TG),總膽固醇(Total cholesterol, TC)和血糖水平。4.心功能測定在糖尿病誘導(dǎo)后16周,應(yīng)用BP-98A智能鼠尾無創(chuàng)血壓計檢測每組大鼠血壓水平；并采用小動物超聲檢測儀通過二維,M超,脈沖多普勒以及組織多普勒超聲心動圖評價大鼠左室收縮和舒張功能。5.組織學(xué)染色4%多聚甲醛固定大鼠心臟組織,制作石蠟切片進行HE染色,馬松染色和天狼猩紅染色,觀察心臟形態(tài)以及膠原沉積情況。免疫組化染色觀察心肌組織內(nèi)COL Ⅰ, COL Ⅲ的含量。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TUNEL)染色檢測心肌細胞的凋亡率。6.分子生物學(xué)水平檢測提取大鼠心肌組織蛋白,用蛋白質(zhì)印跡(western blot)檢測心肌組織中COL Ⅰ, COL Ⅲ,以及轉(zhuǎn)化生長因子β Ⅰ(TGF-βⅠ)的含量。并采用caspase-3活性檢測試劑盒檢測心肌組織中caspase-3的活性。同時檢測PI3K, Akt/p-Akt, ERK/p-ERK、JNK/p-JNK、P38/p-P38等信號通路分子蛋白的含量。第二部分1.細胞培養(yǎng)從新生3天內(nèi)的SD大鼠乳鼠心臟組織中提取原代成纖維細胞(cardiac fibroblasts; CFs)。分為以下四組：正常對照組(Con組；5.5mM)；高糖組(HG組; 30mM) ;高糖+Lv-vehicle組(HG+Lv-vehicle組)；高糖+Lv-PHB-組(HG+Lv-PHB+組)。2.免疫熒光采用激光共聚焦顯微鏡檢測正常條件下及高糖刺激條件下CFs內(nèi)抗增殖蛋白的分布情況。3.細胞增殖檢測采用EDU及CCK8試劑盒檢測各組CFs的增殖情況。4.明膠酶譜采用明膠酶譜法檢測CFs細胞內(nèi)及培養(yǎng)基上清中MMP-2和MMP-9的活性。5.分子生物學(xué)水平檢測提取CFs蛋白,采用western blot檢測心肌組織中COL Ⅰ,COLⅢ,以及TGF-βⅠ的含量。第三部分1.細胞培養(yǎng)同上所述,將H9C2心肌細胞分為Con組、HG組、HG+Lv-vehicle組和HG+Lv-PHB+組。2.細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平檢測采用熒光探針DHE試劑盒檢測H9C2心肌細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。3.心肌細胞凋亡檢測采用7-AAD/Annexin V-PE試劑盒檢測H9C2心肌細胞的凋亡水平。4.分子生物學(xué)水平檢測提取H9C2心肌細胞及線粒體蛋白,檢測bax.bcl-2以及細胞色素c的蛋白表達水平。并采用caspase-3活性檢測試劑盒檢測心肌細胞中caspase-3的活性。統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS v16.0(SPSS Inc.,Chicago, IL)軟件分析并處理數(shù)據(jù),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示.研究結(jié)果第一部分1.大鼠生化指標(biāo)經(jīng)過4周的高脂肪飲食后,三組糖尿病組大鼠的腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實驗和腹腔內(nèi)胰島素耐量實驗的曲線下面積(AUC)均高于普通飲食組大鼠。20周后,糖尿病大鼠空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平明顯高于正常對照組大鼠,但PHB過表達沒有降低TC,TG和空腹血糖水平。然而,20周后,PHB過表達組大鼠胰島素耐量實驗曲線下面積低于對照組大鼠,說明糖尿病大鼠的胰島素抵抗水平有一定改善。2.心臟形態(tài)和心功能在糖尿病組大鼠,PHB蛋白表達水平顯著低于對照組,而PHB過表達能明顯增加心肌組織中PHB的表達。20周后,糖尿病組大鼠呈現(xiàn)出離心性肥大的特點。實驗?zāi)?糖尿病大鼠心臟左心室的射血分數(shù)(LVEF),短軸縮窄率(FS),舒張期二尖瓣環(huán)血流速度(E/A)以及E'/A' 均低于正常大鼠。相比之下,左室舒張末內(nèi)徑(LVEDd)高于正常飲食組大鼠。PHB過表達能顯著改善這些心臟超聲學(xué)指標(biāo)：與空載體對照組相比,能顯著提高LVEF,FS,E/A,E' /A'并降低LVEDd.糖尿病大鼠的血壓略增加,但沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)意義。3.纖維化和凋亡水平馬松染色和天狼猩紅染色顯示糖尿病大鼠心肌間質(zhì)膠原累積顯著高于正常大鼠。與空載體對照組相比,PHB過表達減少了間質(zhì)以及血管旁的膠原蛋白沉積。同樣,TUNEL染色顯示,PHB能夠改善糖尿病大鼠心肌組織的凋亡水平。4.分子生物學(xué)水平檢測結(jié)果顯示,糖尿病能夠增加纖維化標(biāo)志物COL Ⅰ, COL Ⅲ以及TGF-βⅠ的表達,與免疫組化結(jié)果相一致,PHB顯著降低這些標(biāo)志物的表達水平。另外,糖尿病顯著增加心肌caspase-3活性和bax/bcl-2的比值,與TUNEL染色一致,PHB能夠降低這些過量表達的凋亡相關(guān)指標(biāo)。我們進一步研究發(fā)現(xiàn),與正常大鼠心肌組織相比,糖尿病能夠降低PI3K,p-Akt以及p-P38在心肌組織中的的蛋白水平,而PHB過表達可以提高這些蛋白的含量。并且,PHB可以降低高血糖引起的大鼠心肌組織中p-ERK蛋白的增高。第二部分1.PHB在成纖維細胞中的表達與定位蛋白印記實驗結(jié)果顯示,在高糖刺激下PHB隨著時間的變化呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢。通過激光共聚焦顯微鏡觀察到,相對于正常環(huán)境,高糖環(huán)境下的成纖維細胞核中PHB表達增多。2.成纖維細胞增殖檢測EDU及CCK8試劑盒檢測結(jié)果表明,高糖可以促進CFs的增殖,而PHB過表達可以降低CFs的增殖水平。3.分子生物學(xué)檢測與體內(nèi)實驗結(jié)果相似,蛋白印記實驗顯示,在高糖刺激的CFs蛋白中,COLⅠ, COLⅢ,以及TGF-βⅠ的表達均顯著增高；明膠酶譜實驗及western結(jié)果顯示,高糖刺激同時能夠增加MMP-2和MMP-9的含量及活性。PHB在體外依然能夠降低這些纖維化標(biāo)記物的表達并能降低MMP-2的表達。第三部分1.PHB在H9C2心肌細胞中的表達與成纖維細胞類似,在H9C2心肌細胞中PHB的表達亦呈現(xiàn)先是略微增高后逐漸降低的趨勢,但是達到高峰的時間點不同。2.H9C2心肌細胞氧化應(yīng)激水平檢測DHE染色顯示,與正常對照組相比,高糖刺激能夠增加H9C2心肌細胞中活性氧的生成,而PHB過表達能有效降低心肌細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。3.H9C2心肌細胞凋亡檢測流式結(jié)果顯示,PHB過表達能夠降低高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細胞PE染色陽性率,即細胞的早期凋亡率。進一步在分子水平上,PHB不僅可以阻止高糖刺激引起的細胞色素c從線粒體釋放到胞漿中,還可以降低細胞內(nèi)bax/bCl-2的比值,以及caspase-3的活性。結(jié)論1.PHB基因過表達可以有效改善糖尿病大鼠的心功能及纖維化。2.PHB基因過表達對高糖誘導(dǎo)的新生大鼠原代成纖維細胞的異常增殖,異常膠原分泌起到有效緩解的作用。3.PHB基因過表達能夠抑制高糖誘導(dǎo)的H9C2細胞心肌凋亡,改善心肌細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。4.PHB在糖尿病心肌病中的作用與PI3K/Akt以及MAPK信號通路相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R542.2
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本文編號：1479563