本文關鍵詞： EBLN1 基因 系統(tǒng) 進化 分析 及其 生物學 功能 研究　出處：《重慶醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(human endogenous retroviruses,HERV)是在病毒感染過程中,其DNA整合到人類基因組并經(jīng)過長期遺傳而產(chǎn)生的。人類基因組中約8%的基因來自于內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。HERV參與胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等多種人體正常生理功能。在分子水平上,HERV可通過多種方式參與基因表達調(diào)節(jié),如啟動子、增強子或沉默子、多聚腺苷酸化信號、各種核蛋白結(jié)合位點。研究表明,HERV的異常表達與人類某些疾病的發(fā)生密切相關,主要包括神經(jīng)精神疾病、癌癥和免疫性疾病。如HERV-W1在多種惡性腫瘤中呈高表達和異�；罨Ｒ蚨�,深入研究HERV的生物學功能有利于揭示人類疾病的致病機制,HERV有望成為治療的新靶點。EBLN(endogenous borna-like N elements)與博爾納病病毒(borna disease virus,BDV)核蛋白(P40)具有高度同源性的內(nèi)源性非逆轉(zhuǎn)錄病毒。迄今為止,在人類基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個EBLNs,分別命名為EBLN1~EBLN7。其中,EBLN1與BDV N蛋白氨基酸序列的同源性最高。目前人們對EBLN1的生物學功能了解甚少。已證實,EBLN1不僅高表達于293T、MOLT4細胞,而且在少突膠質(zhì)(oligodendroglia,OL)細胞、神經(jīng)母細胞(SY5Y)、人膠質(zhì)瘤細胞(U87)等神經(jīng)腫瘤細胞中也呈高表達。提示EBLN1可能在維持神經(jīng)腫瘤的惡性表型中具有重要作用。BDV是一種單股負鏈RNA病毒,包含6個開放閱讀框(open readingframe,orf),至少表達6個病毒蛋白(n、p、x、l、g和m),其中蛋白n(p40)和p(p23)是bdv致病的關鍵因子。bdv具有高度嗜神經(jīng)性,主要侵犯邊緣系統(tǒng)。動物實驗表明,bdv感染可引起宿主行為異常、情緒異常和學習記憶障礙。流行病學調(diào)查表明,bdv感染率在精神分裂癥、雙相情感障礙等神經(jīng)精神疾病的患者明顯高于正常對照組。bdv可能是人類神經(jīng)精神疾病的致病之一。由此推測,ebln1的生物學功能可能也與神經(jīng)系統(tǒng)有關。目的1、在完成對5個bdv病毒株(hu-h2、husa1、dessau、cresalo和wr3)全基因組測序的基礎上,分析ebln1與人源性bdvn基因的系統(tǒng)進化關系。2、觀察rnai技術抑制ebln1后ol細胞、sy5y細胞、u87細胞生物特性的變化,以探討ebln1在神經(jīng)腫瘤中的作用。3、觀察ebln1蛋白表達對海馬神經(jīng)元的影響及對大鼠學習記憶能力的影響,以探討ebln1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中的生物學功能。方法1、采用rt-pcr技術擴增5個bdv病毒株的全基因組序列;用dnaman軟件將5個病毒株全序列與從genbank中獲取的bdv全長序列進行同源性比較;用mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。同時進行ebln1與人源性bdvn基因進行同源性比較和系統(tǒng)進化分析。2、構(gòu)建ebln1干擾慢病毒載體,感染ol細胞、sy5y細胞、u87細胞,分別進行細胞增殖,凋亡、細胞周期、體外克隆、劃痕和transwell等實驗,以評價ebln1干擾對神經(jīng)腫瘤細胞生物學特性的影響。qrt-pcr檢測ebln1干擾對ol細胞基因表達的影響。westernblotting檢測周期和凋亡相關蛋白表達水平。3、構(gòu)建ebln1表達的慢病毒載體和腺相關病毒載體,分別感染海馬神經(jīng)元和大鼠海馬定位注射。免疫熒光檢測ebln1蛋白的細胞定位。基因芯片檢測ebln1蛋白對神經(jīng)元基因表達的影響。westernblotting檢測突觸可塑料性相關蛋白的水平。水迷宮實驗評價大鼠的學習記憶能力。結(jié)果1、來自不同宿主的5個bdv病毒株(hu-h2、husa1、dessau、cressalo和wr3)的全基因組擴增和測序。進一步分析得出,人源性bdv病毒株與非人源性病毒株之間的同源性為98.07~99.97%;人源性bdv病毒株在親緣關系上具有地域特征。此外,ebln1與人源性bdvn基因的同源性為47.6%~50.82%,并且與來自德國病人bdvn基因具有緊密的親緣關系。2、ebln1干擾能夠?qū)е耾l、sy5y和u87細胞生物特性的改變,分別表現(xiàn)為:ol細胞增殖受抑、凋亡增加,體外克隆形成減少;sy5y細胞運動遷徙能力減低;u87細胞增殖受抑、凋亡增加、體克隆形成減少,同時運動遷徙能力減低。ebln1干擾ol細胞后,3個與膠質(zhì)細胞瘤的增殖和凋亡密切相關的基因rnd3、osmr和creb3l2呈高表達。ebln1干擾ol細胞后,凋亡抑制蛋白bcl-2的表達明顯減低。而bax、caspase3和p53的表達在ebln1干擾前后無明顯差異。3、ebln1蛋白定位于胞漿。ebln1蛋白在神經(jīng)元表達后,檢測到有顯著表達差異的基因170個,上調(diào)基因10個,如nefm、ccdc148、gpr85等;下調(diào)基因160個,包括des、abcd5、golga6c、anxa2、parp4等。go富集分析發(fā)現(xiàn),差異基因的功能主要集中在細胞周期、rna轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色體的固縮和分離等。kegg分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要與核糖體信號通路有關。同時,ebln1蛋白可導致神經(jīng)元突觸相關蛋白psd95和perk的表達水平增加。然而,水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)ebln1蛋白表達前后,大鼠的學習記憶能力無明顯影響。結(jié)論1、人源性bdv病毒株與非人源性bdv病毒株之間具有很高的同源性。bdv病毒在親緣關系上具有地域性。ebln1與人源性bdv病毒株具有緊密的親緣關系。2、ebln1干擾能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)腫瘤細胞的惡性表型,提示ebln1在神經(jīng)腫瘤中具有促癌基因的作用。3、ebln1蛋白可導致突觸可塑性相關蛋白和信號通路活化,但其對學習記憶功能的影響尚需進一步研究證實。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373

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1 何鵬;人EBLN1基因系統(tǒng)進化分析及其生物學功能研究[D];重慶醫(yī)科大學;2016年

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本文編號：1479173