本文關鍵詞： 中國大鯢 TLR7 MyD88 基因克隆 結構 表達特征 NF-κB　出處：《上海海洋大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：TLR家族作為先天性免疫的重要成員之一,是機體抵御病原微生物的第一道防線,TLR識別病原相關分子模式后,通過MyD88依賴途徑或TRIF信號傳導途徑,激活轉錄因子NF-κB和干擾素調節(jié)因子,從而誘導炎癥因子的產(chǎn)生。目前在人、鼠、非洲爪蟾、斑馬魚均已發(fā)現(xiàn)TLR家族成員。中國大鯢(Chinese giant salamander,Andrias davidianus)俗稱娃娃魚,是我國特有的珍稀兩棲類,也是世界上體形最大的兩棲動物。大鯢作為原始物種,具有水生向陸生過渡的進化特征和生理學特點,因此在研究物種起源、進化和免疫系統(tǒng)分子生物學等方面具有重要的研究價值。然而,近年來大鯢人工養(yǎng)殖的快速發(fā)展,養(yǎng)殖病害問題日漸突出,大鯢虹彩病毒(giant salamander iridovius,GSIV)感染大鯢引起重大的經(jīng)濟損失。因此,開展大鯢病原生物感染與宿主防御機制研究,不僅具有重要的科學意義,也具有較為廣泛的應用前景。與其他水生生物相比,目前對大鯢的免疫系統(tǒng)以及分子免疫學研究很少。本文運用RACE-PCR技術克隆了大鯢TLR7(CgsTLR7)和MyD88(CgsMyD88)基因的cDNA全長,分析其分子結構特征與功能,利用熒光定量PCR的方法檢測CgsTLR7和CgsMyD88基因在健康大鯢組織中的表達模式,以及GSIV感染后免疫基因的應答規(guī)律。并對CgsMyD88蛋白在大鯢肌肉細胞(GS-M)中的定位及其過表達對NF-κB的誘導作了初步的研究,旨在為系統(tǒng)研究大鯢免疫系統(tǒng)進化、結構功能以及抗感染分子免疫機制等奠定基礎。主要結果如下:1.以大鯢腎臟組織的總RNA為模板,采用RACE PCR擴增技術,克隆得到CgsTLR7和CgsMyD88 cDNA序列全長。分別為3747bp和1423bp,預測其開放閱讀框分別為3150bp和879bp,分別編碼1049和292個氨基酸;其中5'UTR分別為144bp和387bp,3'UTR分別為453bp和157bp。應用SMART軟件預測其功能結構域,結果顯示,CgsTLR7蛋白有一個胞外信號肽、19個亮氨酸重復區(qū)域以及一個胞內TIR結構域;CgsMyD88蛋白N端存在典型死亡結構域和C端TIR結構域。并且CgsTLR7和CgsMyD88的TIR都含三個保守的Box區(qū)域,用于信號的轉導。序列比對分析結果顯示CgsTLR7與巴西錦龜、非洲爪蟾和雞的同源性分別為71%、64%和65%。CgsMyD88非洲爪蟾和巴西錦龜同源性最高,均為73%,與雞的同源性為69%。分別將CgsTLR7和CgsMyD88推定的氨基酸序列與其它脊椎動物的構建系統(tǒng)發(fā)育樹,二者結果相似,所構建的進化樹均分為兩支,一枝是魚類,另一枝是哺乳動物、禽類、爬行類和兩棲類。與非洲爪蟾聚為一枝,與巴西錦龜相距也較近。2.實時熒光定量PCR分析結果顯示:CgsTLR7和CgsMyD88的mRNA在所檢測的組織中均有表達。其中CgsTLR7 mRNA在肝臟組織中表達水平最高,腸表達量最低;CgsMyD88 mRNA在大鯢腎臟組織中表達水平最高,肌肉和肝臟組織中表達量最低。注射大鯢GSIV后,腎、脾的CgsTLR7的表達均出現(xiàn)明顯上調,分別在12h、48h達到峰值。大鯢感染GSIV 6h后,脾臟中MyD88的表達量出現(xiàn)明顯的上調,24h有所降低,48h表達量達到峰值,72h后表達量降低,但仍比對照組高;在腎臟組織中,感染GSIV 6h后,MyD88表達量有所降低,48h表達量最高。以上結果表明,CgsTLR7和CgsMyD88在大鯢天然免疫中可能起著重要作用。3.構建真核表達載體pcDNA3.1(+)-MyD88轉染大鯢肌肉細胞(GS-M),利用間接熒光免疫化學染色技術,以抗His抗體作為一抗染色,結果顯示:CgsMyD88蛋白在細胞質中有大量表達,少部分分布在細胞核中。為了驗證CgsMyD88是否能夠激活轉錄因子NF-κB,將pcDNA3.1(+)-MyD88質粒、pNF-κB-Luc質粒和pRL-TK質粒共同轉染于GS-M細胞,用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測,結果表明,轉染CgsMyD88報告基因活性是對組照組的1.88倍說明CgsMyD88能夠激活下游的轉錄因子NF-κB活性。
[Abstract]:As an important member of the TLR family of innate immunity, is the body's first line of defense against pathogens, TLR recognize pathogen associated molecular patterns, through a MyD88 dependent pathway or TRIF signaling pathway, activation of transcription factor NF- kappa B and interferon regulatory factor, so as to induce the production of inflammatory factors. At present, rat. Xenopus laevis, a member of the TLR family have been found in zebrafish. China (Chinese giant salamander, the giant salamander salamander, Andrias davidianus) is a rare amphibian species endemic to China, is the world's largest body of amphibious animals. The giant salamander as primitive species, evolution characteristics and physiological characteristics of aquatic to terrestrial transition, so in study on the origin of species, has the important research value of immune system evolution and molecular biology and so on. However, the rapid development of artificial breeding of giant salamander breeding in recent years, the disease is Prominent, giant salamander iridovirus (giant salamander, iridovius, GSIV) infection of giant salamander caused a great economic loss. Therefore, to carry out the study of giant salamander pathogen infection and host defense mechanism, not only has important scientific significance, but also has extensive application prospects. Compared with other aquatic organisms, the little immune system to the giant salamander and molecular immunology research. This paper uses the RACE-PCR cloning of giant salamander TLR7 (CgsTLR7) and MyD88 (CgsMyD88) full-length cDNA gene and analysis of its molecular structure and function, detect the expression patterns of CgsTLR7 and CgsMyD88 gene by real-time fluorescence quantitative PCR method in health salamander tissues, and the immune response gene GSIV after infection and the CgsMyD88 law. Protein in giant salamander muscle cells (GS-M) in the localization and induction of NF- kappa B has made preliminary research on the expression, to study the immune system System evolution, lay the foundation for structure function and anti infection immune molecular mechanism. The main results are as follows: 1. with the total RNA of giant salamander kidney tissue using RACE as template, PCR amplification, cloned full-length CgsTLR7 and cDNA sequences. The CgsMyD88 were 3747bp and 1423bp, the predicted open reading frame were 3150bp and 879bp respectively, encoding 1049 and 292 amino acids; the 5'UTR were 144bp and 387bp, 3'UTR were 453bp and 157bp. using SMART software to predict the functional domain, results showed that CgsTLR7 protein has an extracellular signal peptide, TIR domain 19 leucine repeat region and a cytoplasmic CgsMyD88 protein; N end domain and C the typical structure of death terminal TIR domain and CgsTLR7 and CgsMyD88. TIR contains three conserved Box region for signal transduction. Sequence analysis results showed that the CgsTLR7 and Brazil Jin turtle, x.laevis and chicken The homology was 71%, 64% and 65%.CgsMyD88 of Xenopus laevis and Brazil Jin turtle highest homology were 73%, with chicken 69%. homology respectively to construct phylogenetic tree of amino acid sequences of CgsTLR7 and CgsMyD88 and other putative vertebrate, the results of the two similar constructed phylogenetic tree is divided into two branches one is, the other branches are fish, mammals, birds, reptiles and amphibians. And Xenopus laevis were clustered into one branch, and Brazil are also close to painted turtle.2. real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that CgsTLR7 and CgsMyD88 mRNA were expressed in all detected tissues. The CgsTLR7 mRNA in the liver the expression level is the highest, the lowest expression of intestinal CgsMyD88; mRNA in giant salamander kidney tissue expression level is the highest, the lowest expression in muscle and liver. After GSIV injection of giant salamander kidney, spleen, the expression of CgsTLR7 was up-regulated at points, In 12h, 48h reached the peak GSIV after 6h infection. The giant salamander, the expression of MyD88 in spleen was increased, 24h decreased, 48h expression reached the peak, the expression of 72h decreased, but still higher than the control group; in the kidneys, GSIV infection after 6h, the expression of MyD88 decreased 48h, the highest expression level. These results indicate that CgsTLR7 and CgsMyD88 may play an important role in.3. to construct the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 in innate immunity in giant salamander (+) -MyD88 was transfected into giant salamander muscle cells (GS-M), using indirect immunofluorescence staining technique with anti His antibody as the first antibody staining, the results showed that: CgsMyD88 protein there are a lot of expression in the cytoplasm, a small part of the distribution in the nucleus. In order to verify whether the CgsMyD88 can activate the NF- transcription factor kappa B, pcDNA3.1 (+) -MyD88 plasmid, pNF- kappa B-Luc and pRL-TK plasmid were co transfected into GS-M cells, using double fluorescein The results showed that the enzyme reporter gene system detection, transfection of CgsMyD88 reporter gene activity is 1.88 times of that group group CgsMyD88 can activate the activity of NF- transcription factor kappa B downstream.

【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4;Q78

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