本文關(guān)鍵詞：人HCN4基因真核表達質(zhì)粒構(gòu)建及在HEK293細胞中的表達　出處：《皖南醫(yī)學院學報》2016年06期 　論文類型：期刊論文

  更多相關(guān)文章： HCN基因 轉(zhuǎn)染 異源性表達 HEK細胞

【摘要】：目的:構(gòu)建人HCN4基因的真核表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人胚胎腎細胞,建立異源性表達HCN4通道模型。方法:通過聚合酶鏈反應(yīng)擴增人HCN4基因全長核苷酸序列,雙酶切(Xho I和EcoRI)后插入真核表達質(zhì)粒p IRES2-EGFP中,構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒p IRES2-HCN4-EGFP。應(yīng)用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒p IRES2-HCN4-EGFP轉(zhuǎn)染入HEK293細胞中進行表達。全細胞膜片鉗技術(shù)檢測HCN4通道電流。結(jié)果:酶切及測序的結(jié)果顯示p IRES2-HCN4-EGFP構(gòu)建成功,倒置熒光顯微鏡能觀察到EGFP綠色熒光,反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測到HCN4 mRNA表達,膜片鉗檢測到HCN4基因編碼的通道電流。結(jié)論:成功建立異源性表達HCN4通道模型,為進一步研究HCN4通道電生理特性提供了實驗基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: to construct the eukaryotic expression plasmid of human HCN4 gene and transfect it into human embryonic kidney cells. Methods: the full-length nucleotide sequence of human HCN4 gene was amplified by polymerase chain reaction. Xho I and EcoRI) were digested and inserted into eukaryotic expression plasmid p IRES2-EGFP. Construction of recombinant eukaryotic expression plasmid pIRES2-HCN4-EGFP.The recombinant plasmid pIRES2-HCN4-EGFPwas constructed by liposome method. IRES2-HCN4-EGFP was transfected into HEK293 cells for expression. Whole cell patch-clamp technique was used to detect the current of HCN4 channel. Results: the results of enzyme digestion and sequencing showed that p. IRES2-HCN4-EGFP was successfully built. EGFP green fluorescence was observed by inverted fluorescence microscope and HCN4 mRNA expression was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Conclusion: the heterogenous expression HCN4 channel model was successfully established, which provides an experimental basis for the further study of the electrophysiological characteristics of HCN4 channel.
【作者單位】： 皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院心內(nèi)科;皖南醫(yī)學院活性生物大分子研究安徽省重點實驗室;南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院心內(nèi)科;
【基金】：安徽高校省級自然科學研究項目(KJ2013Z340;KJ2016A728) 活性生物大分子研究安徽省重點實驗室自主研究課題(LAB201403,LAB201401) 安徽省大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(AH201410368150)
【分類號】：R54
【正文快照】： 正常心臟節(jié)律的產(chǎn)生取決于起搏細胞4相自動除極化,而If電流在此除極化過程中起著重要作用[1]。If電流由超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道(HCN通道)開放產(chǎn)生,該通道由HCN基因編碼,其電生理特性是超極化時被激活,呈電壓和時間依賴性,為非選擇性的內(nèi)向陽離子通道[2]。目前已知HCN基

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本文編號：1430696