本文關(guān)鍵詞：花生AhbHLH1參與調(diào)控FAD2基因在種子中表達(dá)的研究

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【摘要】：bHLH轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子中的一個大家族,植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子不僅在植物正常的生長發(fā)育中扮演著重要角色,同時也參與到植物對干旱、鹽及冷脅迫等各種脅迫的應(yīng)答及激素信號傳導(dǎo)等過程。實(shí)驗(yàn)室前期通過同源克隆方法從花生中克隆到了1個與芝麻SebHLH同源的bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因,命名為AhbHLH1。酵母單雜交分析表明,其編碼的蛋白可能與花生FAD2基因啟動子存在相互作用。對花生FAD2基因調(diào)控區(qū)序列分析發(fā)現(xiàn),其起始密碼ATG上游200bp的調(diào)控區(qū)存在4個E-BOX元件,-90bp～78bp存在連續(xù)2個,-155bp處1個,-42bp處1個。本研究中,利用帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了AhbHLH1蛋白,并通過His-Trap親和層析柱對蛋白進(jìn)行了分離純化。合成了3個生物素標(biāo)記的包括不同位置E-BOX的雙鏈DNA探針,并通過電泳遷移率檢測(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)分析了轉(zhuǎn)錄因子AhbHLH1與上述3個探針的結(jié)合能力；同時構(gòu)建了用于瞬時表達(dá)研究AhbHLH1與FAD2基因體內(nèi)相互作用的效應(yīng)載體與報(bào)告載體。為進(jìn)一步研究花生AhbHLH1的功能,構(gòu)建了AhbHLH1的RNAi載體,并與AhbHLH1過表達(dá)載體(實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建)一起分別對花生進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。通過上述研究,取得了以下三方面主要結(jié)果：1. EMSA分析AhbHLH1與AhFAD2基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合。將AhbHLH1的5’端加上6個連續(xù)的His構(gòu)建到原核表達(dá)載體pLM1中,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)帶有His標(biāo)簽的AhbHLH1融合蛋白,并通過His-Trap親和層析柱分離純化了目標(biāo)蛋白。將-90bp～-78bp連續(xù)2個E-BOX及其側(cè)翼序列28bp設(shè)計(jì)為探針P1；-155bp處的E-BOX及其側(cè)翼序列19bp設(shè)計(jì)為探針P2；-42bp的E-BOX及其側(cè)翼序列19bp設(shè)計(jì)為探針P3,分別探究AhbHLH1與這三組探針的結(jié)合情況。AhbHLH1與探針P1特異結(jié)合,與探針P2、P3不結(jié)合。初步證明,AhbHLH1通過與AhFAD2基因啟動子區(qū)域中-90bp～-78bp連續(xù)兩個E-BOX特異性結(jié)合調(diào)控其在種子中的表達(dá)。2.構(gòu)建了用于原生質(zhì)體瞬時表達(dá)分析AhbHLH1與AhFAD2調(diào)控區(qū)體內(nèi)相互作用的效應(yīng)載體與報(bào)告載體。出發(fā)載體pB1121帶有CaMV35S全長啟動子驅(qū)動的GUS表達(dá)框架,克隆100bp最小35S啟動子,替代CaMV35S全長啟動子,構(gòu)建基本報(bào)告載體R0�？寺×伺cE-BOX元件對應(yīng)的三段調(diào)控區(qū)序列I1 (-167bp-24bp)、12 (-148bp-35bp)、I3 (-167bp-55bp),并利用In-Fusion方法分別插入到R0載體最小35S啟動子之前,構(gòu)建了報(bào)告載體R1、R2、R3。為后續(xù)通過原生質(zhì)體瞬時表達(dá)分析AhbHLH1與目的啟動子相互作用做準(zhǔn)備。3. AhbHLH1基因過表達(dá)與RNAi載體的構(gòu)建及花生的遺傳轉(zhuǎn)化。利用SiRNA在線分析工具,對AhbHLH1基因的ORF區(qū)進(jìn)行SiRNA位點(diǎn)的分析,確定目的干擾片段。構(gòu)建了AhbHLH1基因的RNAi載體與過表達(dá)載體(實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建)一同進(jìn)行了花生的遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)卡那霉素篩選與PCR驗(yàn)證,獲得T0代過表達(dá)陽性植株3株,T0代INAi植株3株。下一步,我們將通過瞬時表達(dá)分析,明確AhbHLH1與目的調(diào)控區(qū)相互作用；通過分析過表達(dá)和RNAi抑制AhbHLH1基因轉(zhuǎn)基因花生中AhFAD2基因的表達(dá)狀況,以及轉(zhuǎn)基因花生種子儲藏脂的脂肪組成,進(jìn)一步明確AhbHLH1調(diào)控AhFAD2基因在儲藏脂中不飽和脂肪酸積累過程中的作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

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本文編號：1295327