本文關鍵詞：樺褐孔菌（Inonotus obliquus LNUF008）鯊烯合酶基因工程菌的構建及發(fā)酵生產三萜類物質的初步研究

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【摘要】：樺褐孔菌是一種珍貴的藥用真菌,早在16世紀,東歐民間就用樺褐孔菌防治肺結核、胃腸癌和心血管類疾病,三萜化合物是樺褐孔菌藥用價值的主要活性成分,具有抗氧化、抗腫瘤和抗菌活性,鯊烯合酶(Squalene synthase, SQS)是三萜物質合成途徑中的關鍵酶,其含量和活性決定了三萜化合物的產量。隨著野生資源的日益枯竭及對樺褐孔菌需求量的日益增加,應用現代生物技術提高人工培養(yǎng)樺褐孔菌菌絲體三萜類化合物的產量來滿足人們對樺褐孔菌的需求尤為重要。本文以本實驗室已構建的重組質粒pGAPZaA-SQS為模板,用含有Not Ⅰ和Kpn Ⅰ的引物,通過PCR擴增技術獲得了SQS cDNA序列；用含有相同酶切位點的引物,以絲狀真菌表達載體pAN7-1為模板,通過PCR擴增技術獲得了pAN7-1-△hph基因片段；兩片段經T4 DNA連接酶連接,成功構建了重組表達載體pAN7-1-SQS。用溶壁酶(lywallzyme)酶解樺褐孔菌的菌絲膜,成功制備了樺褐孔菌的原生質體,篩選到了適合樺褐孔菌原生質體再生的培養(yǎng)基。pAN7-1-SQS與含潮霉素抗性基因的載體pAN7-1經過線性化后共轉化樺褐孔菌原生質體,經原生質體再生及抗生素篩選,成功獲得了陽性菌株。以工程菌的基因組為模板,通過設計跨內含子的引物,經PCR擴增技術驗證了陽性菌株基因組中存在pAN7-1-SQS上的SQS cDNA序列；同時,以工程菌的基因組為模板,通過設計擴增SQS編碼區(qū)的引物,通過PCR擴增技術驗證了陽性菌株基因組中同時存在SQS基因序列和SQS cDNA序列,膠回收后測序,結果與理論一致,說明pAN7-1-SQS已轉入陽性菌株。對樺褐孔菌SQS基因工程菌的三萜化合物的產量及菌絲干重進行初步測定,結果顯示,與野生型樺褐孔菌相比,三萜化合物產量提高了34%,而菌絲干重沒有明顯變化,說明工程菌生長良好。本實驗為進一步研究樺褐孔菌藥用價值及提高三萜化合物的產量奠定了基礎。
【學位授予單位】：遼寧大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TQ920.1;Q78

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中國期刊全文數據庫 前10條

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本文編號：1295153