本文關(guān)鍵詞：蛹蟲草Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2基因表達(dá)調(diào)控、抗體制備及蛋白表達(dá)檢測

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【摘要】：生物體內(nèi)都存在自身能夠控制生理節(jié)律的生物鐘。生物鐘蛋白FRQFREQUENCY(FRQ)、藍(lán)光受體White Colar-1(WC-1)和White Colar-2(WC-2)是真菌生物鐘系統(tǒng)中核心振蕩器的三個重要成分,它們在生物鐘負(fù)反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用。本論文以蛹蟲草(Cordyceps militaris)F411為實驗材料,對蛹蟲草中生物鐘基因Cmfrq(Cordyceps militaris frq)、藍(lán)光受體基因Cmwc-1(Cordyceps militaris wc-1)和Cmwc-2(Cordyceps militaris WC-2)的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了分析,制備了生物鐘蛋白CmFRQ(Cordyceps militaris FRQ)、藍(lán)光受體CmWC-1(Cordyceps militaris WC-1)和Cm WC-2(Cordyceps militaris WC-2)的抗體,并用制備的抗體對蛹蟲草中的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行Western blotting檢測。為了研究Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)調(diào)控情況,本實驗設(shè)計了不同的蛹蟲草培養(yǎng)條件,利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同條件下的Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)。結(jié)果表明,在不同條件下Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)不同。Cmfrq基因相對表達(dá)量最高,Cmwc-2基因其次,Cmwc-1基因最低。當(dāng)蛹蟲草菌絲體從黑暗條件下轉(zhuǎn)入到光照條件下時,frq基因的轉(zhuǎn)錄水平都會上升,這種現(xiàn)象與粗糙脈胞菌中相同�；巫訉嶓w比正常的子實體存在一個更高的Cmfrq表達(dá)量。但蛹蟲草中Cmwc-1和Cmwc-2基因表達(dá)量的差異,預(yù)示著蛹蟲草中復(fù)合體結(jié)構(gòu)可能不同于粗糙脈孢菌中的WCC結(jié)構(gòu)。Cmwc-1的表達(dá)主要集中在子實體的中下段部分,而Cmwc-2的表達(dá)集中在在子實體的頂端和中段部分,這表明在子實體的中間部分可能會更多地形成CmWC-1/CmWC-2復(fù)合體結(jié)構(gòu),這種現(xiàn)象推測與子實體的向光性和伸長有關(guān)。通過生物信息學(xué)分析,設(shè)計引物對Cmfrq部分序列(1561-2727 bp)、Cmwc-1部分序列(1549-2772 bp)和Cmwc-2部分序列(394-1179 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的片段與質(zhì)粒pET-41a(+)連接后,轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,然后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)成功的融合蛋白分子量大小分別為74 kDa、76 kDa和64 kDa。所有的表達(dá)蛋白經(jīng)過純化后用作抗原,制備出了抗體anti-CmFRQF、anti-CmWC-1A和anti-CmWC-2B。CmFRQ蛋白還采用了另外一種方法制備抗體,首先化學(xué)合成三條CmFRQ抗原決定簇短肽FRQ1、FRQ2和FRQ3,偶聯(lián)載體蛋白后作為抗原制備抗體anti-FRQ1、anti-FRQ2和anti-FRQ3。分別提取蛹蟲草菌絲體和子實體的總蛋白,用制備的抗體進(jìn)行Western blotting分析。結(jié)果表明,anti-FRQ2始終可以檢測到蛹蟲草菌絲體和子實體中特異的50 kDa(CmFRQ50)和31 kDa(CmFRQ31)蛋白質(zhì)雜交帶。在子實體中在40 kDa和50 kDa之間還存在兩條雜交帶。此外,菌絲體和子實體的不同生長時期,CmFRQ50和CmFRQ31蛋白質(zhì)相對含量會出現(xiàn)變化,表明生物鐘蛋白CmFRQ的存在形式可隨著蛹蟲草的生物學(xué)性狀變化而發(fā)生變化。anti-CmFRQ在Western blotting中可檢測到菌絲體中的CmFRQ100,但CmFRQ100在子實體中不能檢測到。CmWC-1在菌絲體和子實體中存在不同的形式:菌絲體中存在CmWC1-42和CmWC1-48兩種形式,而在子實體中只存在CmWC1-42一種形式,推測CmWC1-48含有LOV結(jié)構(gòu)域。蛹蟲草F411的CmWC-2在菌絲體和子實體中存在相同的形式CmWC2-50。本研究初步分析了Cmfrq、Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)調(diào)控關(guān)系,并檢測了CmFRQ、CmWC-1和CmWC-2在蛹蟲草中的存在形式,這對進(jìn)一步研究蛹蟲草的生物鐘系統(tǒng)提供了依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：江西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S567.35;Q78

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本文編號：1263094