本文關(guān)鍵詞：鯉魚RORγ和STAT3基因的克隆及對Th17細(xì)胞免疫功能影響

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【摘要】：輔助性T細(xì)胞是組成型表達(dá)TCRαβ和CD4分子的T細(xì)胞,根據(jù)CD4+T細(xì)胞在受到病原刺激的情況所分泌的細(xì)胞因子不同將其分為Ⅰ型輔助性T細(xì)胞(Th1)、Ⅱ型輔助性T細(xì)胞(Th2)和Th17細(xì)胞。其中Th17細(xì)胞的名字來源就在于它能夠主要產(chǎn)生IL-17(IL-17A和IL-17F),由它分化而來的天然免疫組分會在適應(yīng)性免疫與天然免疫共同對抗炎癥反應(yīng)構(gòu)建的第一道防線中起作用,而它大多數(shù)功能都是由其分泌物,即IL-17所決定的。Th17的作用包括招募中性粒細(xì)胞、激活天然免疫細(xì)胞、增強(qiáng)B細(xì)胞功能、釋放促炎性細(xì)胞因子如TNF和IL-1β等。另外IL-17信號通路還可以促進(jìn)細(xì)胞因子和其他炎癥因子,如胞間粘附分子、抗菌肽和金屬蛋白酶的分泌,從而維持正常的機(jī)體環(huán)境,避免組織損傷。Th17細(xì)胞可由IL-6,TGF-β,IL-21和IL-23共同誘導(dǎo)分化成為成熟Th17細(xì)胞,這過程還依賴信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子STAT3的激活。另外視黃酸相關(guān)孤兒受體RORγ和RORα也能夠作為轉(zhuǎn)錄因子參與Th17細(xì)胞的分化,而RORγ的轉(zhuǎn)錄活性同時(shí)又受到STAT3的調(diào)控。目前在硬骨魚中,只有斑馬魚和草魚的ROR基因被鑒定出來,包括RORα1,RORα2,RORβ,RORγ1和RORγ2,并且人們在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中對這幾個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測,但對其免疫調(diào)控方式和魚類中的免疫學(xué)功能并未有研究。而STAT3在硬骨魚中雖研究相對較多,但在鯉魚中STAT3基因克隆與功能研究并無相關(guān)報(bào)道。本論文以鯉魚為研究模型,首先根據(jù)STAT3和RORγ的保守區(qū)設(shè)計(jì)多對引物克隆得到部分片段并將其進(jìn)行拼接,首次得到了總長度為2157bp的STAT3基因完整ORF(開放閱讀框)和長度為732bp的RORγ基因編碼片段。用SMART軟件進(jìn)行蛋白預(yù)測分析,確定STAT3含有一個(gè)STAT-int(2-122)結(jié)構(gòu)域及一個(gè)SH2特征性結(jié)構(gòu)域(583-664),同時(shí)還有兩個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域(136-223,268-292)。鯉魚RORγ基因的732bp核苷酸編碼243個(gè)氨基酸,其中在46-202之間構(gòu)成了HOLI結(jié)構(gòu)域。我們對該序列與多物種進(jìn)行比對構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)鯉魚與草魚的RORγ基因處于同一分支,相似性為85%,而STAT3的親緣關(guān)系與斑馬魚最為接近。為進(jìn)一步研究Th17細(xì)胞所分泌細(xì)胞因子的免疫功能,我們選取了鯉魚IL-17AF2基因作為Th17細(xì)胞的功能代表性細(xì)胞因子,克隆得到其部分片段后并通過熒光定量PCR分析其組織分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-17AF2在頭腎中表達(dá)量最高,肝臟次之,其次為脾臟、皮膚、前腸、后腸和鰓。為研究病毒感染后鯉魚免疫系統(tǒng)中IL-17AF2的表達(dá)變化,我們用PolyI:C注射刺激鯉魚,同時(shí)隊(duì)體外鯉魚頭腎白細(xì)胞進(jìn)行刺激,分別在不同的時(shí)間段運(yùn)用Real-time PCR檢測其mRNA水平,結(jié)果顯示鯉魚IL-17AF2基因的表達(dá)量均被上調(diào),其中在頭腎和皮膚中含量升高最明顯,而在鰓中的升高變化量較小。其中在IL-17AF2基因表達(dá)上調(diào)最明顯的組織和時(shí)間段內(nèi),STAT3和RORγ的含量均有相應(yīng)的升高。綜上檢測結(jié)果說明IL-17AF2與鯉魚的抗病毒免疫反應(yīng)有關(guān),而Th17的功能發(fā)揮很可能與STAT3和RORγ相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S943

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本文編號：1262804