本文關(guān)鍵詞：利用基于CRISPR-Cas9的基因編輯技術(shù)對(duì)miR-29a在GT1-7細(xì)胞中進(jìn)行基因敲除

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【摘要】：目的:本文利用CRISPR-Cas9技術(shù)在GT1-7細(xì)胞中對(duì)miR-29a基因進(jìn)行基因編輯,用于構(gòu)建miR-29a基因敲除GT1-7細(xì)胞模型。方法:通過(guò)構(gòu)建Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)的GT1-7細(xì)胞株并轉(zhuǎn)染sgRNA質(zhì)粒用于在靶向miR-29a基因區(qū)域引發(fā)突變。然后構(gòu)建EGFP與sgRNA共表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)GT1-7細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀富集表達(dá)綠色熒光蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞和分選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。最后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)對(duì)富集細(xì)胞和單克隆細(xì)胞進(jìn)行miR-29a表達(dá)量檢測(cè)。結(jié)果:T7E1檢測(cè)結(jié)果顯示CRISPR-Cas9系統(tǒng)有效地在miR-29a基因區(qū)域引發(fā)了突變。熒光定量PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,富集后陽(yáng)性細(xì)胞miR-29a的表達(dá)量整體下降了50%左右(P0.05)。此外,通過(guò)流式篩選獲得了一個(gè)純合miR-29a基因敲除細(xì)胞克隆,與對(duì)照組相比,其miR-29a的表達(dá)量下降了75%左右(P0.05)。結(jié)論:本文建立了一種有效編輯GT1-7細(xì)胞基因的方法,并采用該方法構(gòu)建了miR-29a穩(wěn)定敲除細(xì)胞模型。
【作者單位】： 東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所;
【基金】：中央高�；究蒲袠I(yè)務(wù)專項(xiàng)資金(2232013A3-06)
【分類號(hào)】：Q78
【正文快照】： C hinese L ibrary C lassification(C L C):Q 75;Q 78 D ocument code:AA rticle ID:1 673-6273(201 6)21-4028-04前言M icro R N A s是一類長(zhǎng)度大約為21-22 nt的非編碼單鏈小R N A s,它能通過(guò)靶向結(jié)合m R N A 3'U T R調(diào)控大量生物學(xué)過(guò)程包括細(xì)胞增殖與凋亡、神經(jīng)元分化、腫

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