本文關(guān)鍵詞：苦蕎蘆丁降解酶基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析

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【摘要】：蘆丁作為苦蕎(Fagopyrum tartaricum)中重要的黃酮類化合物,具有抗高血糖、抗高血壓、抗氧化的性質(zhì)。蘆丁降解酶(Rutin degrading enzyme, RDE)是蘆丁分解代謝中的關(guān)鍵酶之一,對(duì)蘆丁產(chǎn)生特異的降解作用,造成終端產(chǎn)品中蘆丁含量顯著降低。本研究通過克隆蘆丁降解酶基因啟動(dòng)子序列,利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其上順式作用元件,并對(duì)其進(jìn)行5｀端截短,原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化以及對(duì)外源信號(hào)物質(zhì)的響應(yīng)規(guī)律進(jìn)行分析,進(jìn)一步揭示蘆丁降解酶基因的調(diào)控機(jī)制,為揭示其生物學(xué)功能及對(duì)苦蕎次生代謝物的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究得到的主要結(jié)論有：(1)苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的制備條件為：以苦蕎葉片為材料,在1.5%纖維素酶R-10+0.5%離析酶R-10+0.5 mol/L mannitol+20 mmol/L MES+20 mmol/L KCl+10 mmol/L CaCl2+0.1% BSA酶解液中,黑暗處理4 h,90×g離心速度收集原生質(zhì)體,可以獲得大量、細(xì)胞膜完整、高活力的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體的產(chǎn)量為6×106個(gè)儋,活力達(dá)到90%以上。(2)通過染色體步移技術(shù)克隆得到了苦蕎FtRDE啟動(dòng)子,長(zhǎng)度為1907 bp。利用生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)FtRDE啟動(dòng)子上的基本元件有：TATA-box (-60 bp)、CAAT-box (-131 bp)和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(-30 bp),同時(shí),還具有1個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(TGACG-motif,-443 bp)、3個(gè)脫落酸響應(yīng)元件(ABRE,-438 bp、-535 bp、-1145 bp)和1個(gè)種子特異性調(diào)節(jié)元件(RY repeat,-94 bp)。(3)通過對(duì)苦蕎FtRDE啟動(dòng)子進(jìn)行5｀端截短,構(gòu)建5個(gè)FtRDE截短啟動(dòng)子重組載體FtRDEPR1、FtRDEPR2、FtRDEPR3、FtRDEPR4和FtRDEPR5,并將其轉(zhuǎn)入苦蕎葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)在FtRDE啟動(dòng)子上-1077 bp至-1829 bp區(qū)域存在抑制其轉(zhuǎn)錄的順式作用元件。并通過實(shí)時(shí)定量分析發(fā)現(xiàn),外源信號(hào)物質(zhì)MeJA和ABA均能上調(diào)FtRDE的表達(dá)量,進(jìn)一步證明了FtRDE啟動(dòng)子上存在響應(yīng)MeJA和ABA的順式作用元件。通過半定量分析發(fā)現(xiàn),在苦蕎灌漿期,FtRDE在種子中表達(dá)量最高,進(jìn)一步證明了FtRDE啟動(dòng)子上存在種子特異性元件的可靠性。(4)分別將FtRDE正向、反向干擾片段和過表達(dá)片段插入到pTCK303載體中,成功構(gòu)建苦蕎FtRDE干擾載體(FtRDEi-pTCK303)和過表達(dá)載體(FtRDEm-pTCK303),為深入研究蘆丁降解酶的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

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