本文關(guān)鍵詞：耐高溫α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的研究

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【摘要】：本論文主要針對(duì)“耐高溫α-淀粉酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)”開(kāi)展系統(tǒng)深入地研究。耐高溫淀粉酶在高溫條件仍具有很高的活性,可滿足工業(yè)高溫生產(chǎn)的需求,因此,被廣泛應(yīng)用于食品、紡織等行業(yè)。耐高溫淀粉酶是食品生產(chǎn)中重要的酶制劑之一。工業(yè)上一般采用微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)耐高溫淀粉酶。而枯草芽孢桿菌因具有生長(zhǎng)環(huán)境要求簡(jiǎn)單、適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)、易于培養(yǎng)、無(wú)致病性等優(yōu)點(diǎn),常被用做食品工業(yè)上耐高溫淀粉酶的生產(chǎn)發(fā)酵菌株。從自然界中獲得的耐高溫淀粉酶的活性較低,不能滿足生產(chǎn)要求。DNA shuffling體外重組技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)改變基因序列,通過(guò)篩選可獲得高酶活的菌株;通過(guò)對(duì)DNAshuffling的條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)突變株進(jìn)行初步篩選,得到兩株疑似突變的菌株。具有寶貴的收藏潛力與利用價(jià)值。構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌B.subtilisWB600/p0613。耐高溫淀粉酶0613基因與穿梭質(zhì)粒plip連接構(gòu)建重組載體p0613。p0613轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.Coli MC1061,構(gòu)建E.Coli MC1061/p0613,經(jīng)驗(yàn)證E.Coli MC1061/p0613能夠表達(dá)0613酶。p0613載體轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌B.subtilis WB600,構(gòu)建B.subtilisWB600/p0613,經(jīng)驗(yàn)證B.subtilis WB600/p0613能夠表達(dá)0613酶。酶學(xué)性質(zhì)研究,熱處理后的酶液經(jīng)Ni Sepharose 6 Fast Flow純化,獲得純酶液。蛋白分子量為73.1kDa,蛋白濃度為0.3863±0.0613mg/ml,酶活為6.853U/mLl。75-100熱處理1h后,相對(duì)酶活為93%-32%。pH3.5-7.0的緩沖液與酶混合,37 12h,相對(duì)活性范圍60%-93%。EDTA及Al~(3+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)對(duì)酶有激活作用,Ca~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)對(duì)酶有抑制作用。酒精濃度為1%時(shí),酶活下降明顯。耐高溫淀粉酶基因0613與1458被DNase水解成50-200bp的小片段。經(jīng)過(guò)無(wú)引物與有引物擴(kuò)增后獲得突變基因。突變基因與不同的質(zhì)粒載體pTKNd6×H、p6×HTKNd連接構(gòu)建mutant0F0R、mutant1F1R、mutant0R1F載體,轉(zhuǎn)化至E.Coli MC1061。利用DNS法篩選高酶活的菌株。本研究對(duì)DNA shuffling條件進(jìn)行優(yōu)化,為獲得性狀優(yōu)良的菌株奠定了良好的基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TQ925.1

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