發(fā)布時間：2017-11-10 03:26

  本文關鍵詞：中國野生華東葡萄抗白粉病基因VpUIRP2和VpUIRP3的表達分析

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【摘要】：葡萄是全球范圍內栽培面積較廣和經濟效益較高的水果之一。世界主栽歐洲葡萄(V.vinifera L.)品種品質優(yōu),但其突出缺點是不抗病,尤其不抗葡萄白粉病。研究葡萄抗病基因,對歐洲葡萄進行定向轉基因改良是解決這一生產問題的有效途徑。我國是葡萄種屬的起源地之一,擁有大量的野生抗病種質資源,前期研究報道了中國野生華東葡萄白河-35-1株系(V.pseudoreticulata accession Baihe-35-1)具有較強抗病性,尤其是抗葡萄白粉病。本研究從以白河-35-1為材料構建的中國野生華東葡萄抗白粉病基因cDNA文庫中篩選到兩條RING型泛素連接酶基因ETS序列,經過同源克隆獲得了基因編碼區(qū)序列,分析了基因的表達特性及轉基因歐洲葡萄的抗病能力,主要取得以下結果:1.同源克隆獲得中國野生華東葡萄泛素連接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的編碼區(qū)序列(CDS)。VpUIRP2定位在五號染色體上,CDS序列為954 bp,編碼317個氨基酸,GenBank登錄號為KU519335;VpUIRP3定位在8號染色體上,CDS序列為1641 bp,編碼546個氨基酸,GenBank登錄號為KU519336。VpUIRP2和VpUIRP3都具有C3H2C3型中RING finger保守結構域。2.對中國野生華東葡萄白河-35-1接種白粉菌,VpUIRP2和VpUIRP3受白粉菌誘導后表達上調,分別在24 h和6 h達到表達高峰,說明VpUIRP2和VpUIRP3的表達響應白粉菌誘導。對中國野生華東葡萄白河-35-1進行水楊酸處理,VpUIRP2和VpUIRP3的表達上調,均在3 h達到表達高峰,說明VpUIRP2和VpUIRP3的表達響應水楊酸的處理。將兩個基因分別與pBI221-GFP載體融合,構建亞細胞定位載體,轉化擬南芥原生質體,亞細胞定位結果表示VpUIRP2蛋白定位在細胞質,VpUIRP3蛋白定位無特異性。3.優(yōu)化了無核白(V.vinifera cv.Thompson Seedless)、紅地球(V.vinifera cv.R ed Globe)、赤霞珠(V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon)器官發(fā)生再生體系。比較了不同BAP濃度的萌芽培養(yǎng)基對無核白、紅地球愈傷組織萌芽成枝的影響,結果表明誘導一個月時,無核白使用BAP濃度為8.8μmol·L-1的IM培養(yǎng)基效果最好,紅地球使用B AP濃度為4.4和8.8μmol·L-1的IM培養(yǎng)基效果最好;誘導兩個月時,紅地球和無核白使用BAP濃度為4.4和8.8μmol·L-1的IM培養(yǎng)基效果最好。比較了不同BAP和NAA濃度對赤霞珠愈傷組織誘導的影響,結果表明,赤霞珠愈傷組織誘導最適合的培養(yǎng)基組合為IM1C培養(yǎng)基(IM+2.668 mg·L-1 BAP),IM2培養(yǎng)基(IM+4.000mg·L-1 BAP)和IM3C培養(yǎng)基(IM+7.336 mg·L-1 BAP)。4.將VpUIRP2和VpUIRP3通過農桿菌介導法遺傳轉化紅地球、無核白。得到13個轉化VpUIRP2紅地球抗性株系,2個轉化VpUIRP3紅地球抗性株系,2個轉化VpUIRP2無核白抗性株系,2個轉化VpUIRP3無核白抗性株系。PCR檢測結果顯示,11個轉化VpUIRP2紅地球株系,2個轉化VpUIRP2無核白株系能檢測到1154bp的目的條帶,Southern檢測結果顯示4個轉化VpUIRP2紅地球抗性株系,1個轉化VpUIRP2無核白抗性株系為陽性株系,陽性率為33.3%。結果表明,VpUIRP2轉入了紅地球、無核白中。VpUIRP3抗性株系未檢測到目標條帶。5.對轉基因株系接種白粉菌,表型觀察轉基因株系的白粉菌生長情況弱于野生株系,苯胺藍染色結果與孢子數統(tǒng)計分析結果表明,168 h轉基因株系中分生孢子數與每毫克葉片中孢子總數均顯著低于野生對照,說明轉基因株系的抗白粉病能力強于未轉基因的野生型紅地球和無核白葡萄植株。中國野生華東葡萄白河-35-1泛素連接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3能增強葡萄對白粉病的抗性,可以作為抗病基因,用于改良歐洲葡萄的抗病性研究。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S436.631

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