發(fā)布時間：2017-11-10 03:26

  本文關(guān)鍵詞：中國野生華東葡萄抗白粉病基因VpUIRP2和VpUIRP3的表達(dá)分析

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【摘要】：葡萄是全球范圍內(nèi)栽培面積較廣和經(jīng)濟(jì)效益較高的水果之一。世界主栽歐洲葡萄(V.vinifera L.)品種品質(zhì)優(yōu),但其突出缺點是不抗病,尤其不抗葡萄白粉病。研究葡萄抗病基因,對歐洲葡萄進(jìn)行定向轉(zhuǎn)基因改良是解決這一生產(chǎn)問題的有效途徑。我國是葡萄種屬的起源地之一,擁有大量的野生抗病種質(zhì)資源,前期研究報道了中國野生華東葡萄白河-35-1株系(V.pseudoreticulata accession Baihe-35-1)具有較強(qiáng)抗病性,尤其是抗葡萄白粉病。本研究從以白河-35-1為材料構(gòu)建的中國野生華東葡萄抗白粉病基因cDNA文庫中篩選到兩條RING型泛素連接酶基因ETS序列,經(jīng)過同源克隆獲得了基因編碼區(qū)序列,分析了基因的表達(dá)特性及轉(zhuǎn)基因歐洲葡萄的抗病能力,主要取得以下結(jié)果:1.同源克隆獲得中國野生華東葡萄泛素連接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3的編碼區(qū)序列(CDS)。VpUIRP2定位在五號染色體上,CDS序列為954 bp,編碼317個氨基酸,GenBank登錄號為KU519335;VpUIRP3定位在8號染色體上,CDS序列為1641 bp,編碼546個氨基酸,GenBank登錄號為KU519336。VpUIRP2和VpUIRP3都具有C3H2C3型中RING finger保守結(jié)構(gòu)域。2.對中國野生華東葡萄白河-35-1接種白粉菌,VpUIRP2和VpUIRP3受白粉菌誘導(dǎo)后表達(dá)上調(diào),分別在24 h和6 h達(dá)到表達(dá)高峰,說明VpUIRP2和VpUIRP3的表達(dá)響應(yīng)白粉菌誘導(dǎo)。對中國野生華東葡萄白河-35-1進(jìn)行水楊酸處理,VpUIRP2和VpUIRP3的表達(dá)上調(diào),均在3 h達(dá)到表達(dá)高峰,說明VpUIRP2和VpUIRP3的表達(dá)響應(yīng)水楊酸的處理。將兩個基因分別與pBI221-GFP載體融合,構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體,轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,亞細(xì)胞定位結(jié)果表示VpUIRP2蛋白定位在細(xì)胞質(zhì),VpUIRP3蛋白定位無特異性。3.優(yōu)化了無核白(V.vinifera cv.Thompson Seedless)、紅地球(V.vinifera cv.R ed Globe)、赤霞珠(V.vinifera cv.Cabernet Sauvignon)器官發(fā)生再生體系。比較了不同BAP濃度的萌芽培養(yǎng)基對無核白、紅地球愈傷組織萌芽成枝的影響,結(jié)果表明誘導(dǎo)一個月時,無核白使用BAP濃度為8.8μmol·L-1的IM培養(yǎng)基效果最好,紅地球使用B AP濃度為4.4和8.8μmol·L-1的IM培養(yǎng)基效果最好;誘導(dǎo)兩個月時,紅地球和無核白使用BAP濃度為4.4和8.8μmol·L-1的IM培養(yǎng)基效果最好。比較了不同BAP和NAA濃度對赤霞珠愈傷組織誘導(dǎo)的影響,結(jié)果表明,赤霞珠愈傷組織誘導(dǎo)最適合的培養(yǎng)基組合為IM1C培養(yǎng)基(IM+2.668 mg·L-1 BAP),IM2培養(yǎng)基(IM+4.000mg·L-1 BAP)和IM3C培養(yǎng)基(IM+7.336 mg·L-1 BAP)。4.將VpUIRP2和VpUIRP3通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化紅地球、無核白。得到13個轉(zhuǎn)化VpUIRP2紅地球抗性株系,2個轉(zhuǎn)化VpUIRP3紅地球抗性株系,2個轉(zhuǎn)化VpUIRP2無核白抗性株系,2個轉(zhuǎn)化VpUIRP3無核白抗性株系。PCR檢測結(jié)果顯示,11個轉(zhuǎn)化VpUIRP2紅地球株系,2個轉(zhuǎn)化VpUIRP2無核白株系能檢測到1154bp的目的條帶,Southern檢測結(jié)果顯示4個轉(zhuǎn)化VpUIRP2紅地球抗性株系,1個轉(zhuǎn)化VpUIRP2無核白抗性株系為陽性株系,陽性率為33.3%。結(jié)果表明,VpUIRP2轉(zhuǎn)入了紅地球、無核白中。VpUIRP3抗性株系未檢測到目標(biāo)條帶。5.對轉(zhuǎn)基因株系接種白粉菌,表型觀察轉(zhuǎn)基因株系的白粉菌生長情況弱于野生株系,苯胺藍(lán)染色結(jié)果與孢子數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果表明,168 h轉(zhuǎn)基因株系中分生孢子數(shù)與每毫克葉片中孢子總數(shù)均顯著低于野生對照,說明轉(zhuǎn)基因株系的抗白粉病能力強(qiáng)于未轉(zhuǎn)基因的野生型紅地球和無核白葡萄植株。中國野生華東葡萄白河-35-1泛素連接酶基因VpUIRP2和VpUIRP3能增強(qiáng)葡萄對白粉病的抗性,可以作為抗病基因,用于改良?xì)W洲葡萄的抗病性研究。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.631

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