本文關(guān)鍵詞：基于基因芯片分析的大腸桿菌丁醇耐受性關(guān)鍵基因的研究

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【摘要】：微生物細(xì)胞的有機(jī)溶劑耐受性在生物催化和轉(zhuǎn)化,生物能源生產(chǎn)及環(huán)境污染治理等應(yīng)用中至關(guān)重要。因此,深入研究微生物細(xì)胞的有機(jī)溶劑耐受機(jī)制,對(duì)于提高微生物菌株有機(jī)溶劑耐受性及其在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的意義。大腸桿菌因其遺傳背景清楚,基因操作簡(jiǎn)單,是一種重要的模式菌株。本研究基于基因芯片分析,對(duì)丁醇脅迫條件下攜帶了σ70突變體B8的丁醇耐受大腸桿菌E.coli JM109/pHACMB8和對(duì)照菌株E.coli JM109/pHACMWT的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:共有329個(gè)差異表達(dá)基因(差異倍數(shù)均在2倍以上,p-value0.05),其中197個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),132個(gè)基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。通過(guò)同源序列聚類分組(COG)數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)差異基因的分布特點(diǎn)及基因的功能進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)與丁醇耐受密切相關(guān)的基因主要有以下幾類功能:能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生成,氨基酸運(yùn)輸與代謝,以及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因的具體代謝路徑進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與乙醛酸和二羧酸代謝,丙酮酸代謝,氨基酸代謝和溶劑外排泵等�；谝陨闲酒Y(jié)果分析,分別采用基因過(guò)表達(dá)和基因敲除的方法對(duì)15個(gè)上調(diào)基因和14個(gè)下調(diào)基因的功能進(jìn)行研究。結(jié)果顯示:上調(diào)基因glcF、gcl、yhaR、ybbQ和tdcE的過(guò)表達(dá)有助于提高大腸桿菌的丁醇耐受性;而將下調(diào)基因yibT、yghW和ybjC敲除后,牛津杯平板中菌落形成數(shù)量與對(duì)照菌株相比在數(shù)量級(jí)上也分別提高了102,102和101倍。為了進(jìn)一步探究關(guān)鍵基因的耐受機(jī)制,本研究對(duì)敲除菌株△yibT和△ygh W的細(xì)胞膜脂肪酸組成和細(xì)胞表面疏水性進(jìn)行了測(cè)定。與對(duì)照菌株相比,敲除菌株的C16:1,C18:1等不飽和脂肪酸含量增加了20%~30%,細(xì)胞表面疏水性升高。同時(shí),采用GFP融合蛋白的方法,鑒定了ybjC基因編碼的膜蛋白。通過(guò)對(duì)ybjC過(guò)表達(dá)菌株的胞內(nèi)丁醇含量測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)丁醇含量比對(duì)照菌株高25%。此外,通過(guò)構(gòu)建glc基因簇中幾個(gè)基因的過(guò)表達(dá)和共表達(dá)菌株,發(fā)現(xiàn)glcA基因過(guò)表達(dá)后,菌株無(wú)法生長(zhǎng);只有當(dāng)共表達(dá)整個(gè)glc基因簇時(shí)菌株才能恢復(fù)正常生長(zhǎng)。最后,本研究對(duì)glcF、glcG和gcl過(guò)表達(dá)菌株發(fā)酵液中的有機(jī)酸含量進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)gcl和glcF過(guò)表達(dá)菌株的丙酮酸濃度分別是對(duì)照菌株的4.66倍和1.63倍,丁醇刺激會(huì)進(jìn)一步提高發(fā)酵液中丙酮酸的含量。通過(guò)以上分析得出以下結(jié)論:(1)敲除菌株△yibT和△yghW丁醇耐受性的提高與細(xì)胞膜脂肪酸組分變化有關(guān)。(2)ybjC基因編碼膜蛋白可能參與溶劑的轉(zhuǎn)運(yùn)。(3)glcA基因受glc基因簇中其他基因的調(diào)控。(4)glcF和gcl基因的過(guò)表達(dá)有助于丙酮酸含量的增加,丁醇刺激會(huì)進(jìn)一步提高丙酮酸的含量,這可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)能發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)大腸桿菌中溶劑耐受性相關(guān)基因的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探究,為基因工程改造微生物提高其溶劑耐受性提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78
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本文編號(hào)：1139018