本文關鍵詞：新疆紫草對羥基苯甲酸香葉基轉移酶基因克隆及功能研究

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【摘要】：紫草素及其衍生物是紫草科植物的重要次生代謝產物,屬于萘醌類化合物,同時也是傳統(tǒng)中藥紫草的有效成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護肝臟及抑制DNA拓撲異構酶等生物學活性。通常認為,紫草素類化合物是通過苯丙氨酸(PP)途徑-甲羥戊酸(MVA)途徑/去氧木酮糖還原(MEP)途徑的復合途徑而合成。在對羥基苯甲酸香葉基轉移酶(PGT)的作用下,MVA/MEP途徑形成的焦磷酸香葉酯(GPP)的香葉烯基轉移到來自PP途徑代謝產物對羥基苯甲酸(PHBA)上,形成香葉基-對羥基苯甲酸(GBA),該化合物是生成紫草素及其衍生物的前幾步反應中的重要前體。前期研究表明,PGT基因的表達與紫草素類化合物的合成直接相關,為此,充分挖掘并克隆對羥基苯甲酸香葉基轉移酶(PGT)基因,可為調控紫草細胞生產紫草素類化合物及構建高效生產紫草素類化合物的代謝工程菌奠定基礎。課題組前期已對新疆紫草進行了轉錄組測序并構建了轉錄組數(shù)據庫,在此基礎上,本研究擬深入開展PGT基因的克隆及功能研究。本研究目的在于：(1)通過轉錄組測序數(shù)據得到PGT基因的全長序列,為揭示PGT催化機理及進行功能鑒定提供靶基因；(2)通過蛋白體外酶促反應及酵母表達菌株發(fā)酵等方法,鑒定候選基因功能,為闡釋酶的生物學特性及紫草素生物合成途徑奠定基礎；(3)通過RT-PCR,檢測PGT在新疆紫草不同細胞系,不同組織器官,不同處理因素下的表達量差異,試圖揭示PGT對于紫草素生物合成的重要意義及內在聯(lián)系；(4)通過構建嵌合基因并進行相應的功能驗證,闡明部分同源序列功能缺失的原因；(5)通過擬南芥原生質體瞬時表達實驗,對AePGTs進行亞細胞定位,并嘗試闡明MVA途徑及MEP途徑在紫草素類化合物生物合成過程中的相互關系。主要研究如下：(1)在已有新疆紫草轉錄組高通量測序數(shù)據中,共得到17條潛在PGT基因序列,經過進一步篩選,最終得到8個候選PGT基因,繼而對其進行了一系列的生物信息學分析,為后期基因的克隆及功能解析奠定基礎；(2)本實驗成功克隆得到了6個候選PGT基因及1個已知的新疆紫草PGT基因,并分別命名為AePGT1、AePGT2、AePGT3、AePGT4、AePGT5、AePGT6、 AePGT。利用RF克隆技術成功將7個AePGTs(包括已經報道的AePGT)構建到pESC-His表達載體中,并且成功表達出相應膜蛋白,繼而以GPP和PHBA為酶促反應底物,進行體外酶促反應,并通過酵母表達菌株發(fā)酵來證實體外酶促,結果表明AePGT4、AePGT6及AePGT具有催化GPP的香葉烯基轉移到PHBA上生成GBA的活性。通過上述研究,成功克隆并得到了能夠編碼具有催化功能PGT蛋白的基因,為闡釋酶的酶學學特性及紫草素生物合成途徑奠定基礎；(3)通過RT-PCR技術,檢測AePGTs在紅色高產懸浮細胞系和白色低產懸浮細胞系、植株的地上部分和地下部分表達量的差異及茉莉酸甲酯(MeJA)處理對其表達量的影響,結果顯示在紫草素類化合物產量較高的新疆紫草紅色高產細胞系及植株的地下部分,AePGTs基因的整體表達量明顯高于白色低產系及植株的地上部分；并且MeJA處理后AePGTs基因的表達量也會明顯升高,且紅色細胞系中的增長幅度顯著高于白色細胞系,這說明新疆紫草PGT基因的表達量與紫草素類化合物的合成密切相關,且呈正相關性；(4)序列比對分析發(fā)現(xiàn)3個與具有催化功能的PGT同源性較高的功能缺失蛋白AePGT2、AePGT3、 AePGT5的N端分別缺少約50-60個氨基酸。為驗證該段序列的功能,本研究將缺失的N段序列與3條功能缺失基因的全長序列通過合成的方式構建嵌合基因,并通過外源表達成功獲得相應嵌合蛋白,AePGT-Cp2、AePGT-Cp3、AePGT-Cp5,繼而進行體外酶促反應,結果表明3個嵌合蛋白均能夠催化GPP和PHBA反應生成GBA,推測導致3個同源蛋白功能缺失的原因是其缺失的N端序列中包含一段與底物結合有關的重要結構域。(5)通過擬南芥原生質體瞬時表達實驗,對AePGT4、AePGT6及AePGT進行業(yè)細胞定位,結果發(fā)現(xiàn)3者均為非質體膜蛋白；結合文獻及紫草素類化合物合成過程中各通路發(fā)生位置,推測PGT為內質網膜蛋白。
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;Q946

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本文編號：1139202