本文關(guān)鍵詞：新疆紫草對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶基因克隆及功能研究

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【摘要】：紫草素及其衍生物是紫草科植物的重要次生代謝產(chǎn)物,屬于萘醌類化合物,同時(shí)也是傳統(tǒng)中藥紫草的有效成分,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)肝臟及抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶等生物學(xué)活性。通常認(rèn)為,紫草素類化合物是通過(guò)苯丙氨酸(PP)途徑-甲羥戊酸(MVA)途徑/去氧木酮糖還原(MEP)途徑的復(fù)合途徑而合成。在對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶(PGT)的作用下,MVA/MEP途徑形成的焦磷酸香葉酯(GPP)的香葉烯基轉(zhuǎn)移到來(lái)自PP途徑代謝產(chǎn)物對(duì)羥基苯甲酸(PHBA)上,形成香葉基-對(duì)羥基苯甲酸(GBA),該化合物是生成紫草素及其衍生物的前幾步反應(yīng)中的重要前體。前期研究表明,PGT基因的表達(dá)與紫草素類化合物的合成直接相關(guān),為此,充分挖掘并克隆對(duì)羥基苯甲酸香葉基轉(zhuǎn)移酶(PGT)基因,可為調(diào)控紫草細(xì)胞生產(chǎn)紫草素類化合物及構(gòu)建高效生產(chǎn)紫草素類化合物的代謝工程菌奠定基礎(chǔ)。課題組前期已對(duì)新疆紫草進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并構(gòu)建了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),在此基礎(chǔ)上,本研究擬深入開(kāi)展PGT基因的克隆及功能研究。本研究目的在于：(1)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)得到PGT基因的全長(zhǎng)序列,為揭示PGT催化機(jī)理及進(jìn)行功能鑒定提供靶基因；(2)通過(guò)蛋白體外酶促反應(yīng)及酵母表達(dá)菌株發(fā)酵等方法,鑒定候選基因功能,為闡釋酶的生物學(xué)特性及紫草素生物合成途徑奠定基礎(chǔ)；(3)通過(guò)RT-PCR,檢測(cè)PGT在新疆紫草不同細(xì)胞系,不同組織器官,不同處理因素下的表達(dá)量差異,試圖揭示PGT對(duì)于紫草素生物合成的重要意義及內(nèi)在聯(lián)系；(4)通過(guò)構(gòu)建嵌合基因并進(jìn)行相應(yīng)的功能驗(yàn)證,闡明部分同源序列功能缺失的原因；(5)通過(guò)擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn),對(duì)AePGTs進(jìn)行亞細(xì)胞定位,并嘗試闡明MVA途徑及MEP途徑在紫草素類化合物生物合成過(guò)程中的相互關(guān)系。主要研究如下：(1)在已有新疆紫草轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中,共得到17條潛在PGT基因序列,經(jīng)過(guò)進(jìn)一步篩選,最終得到8個(gè)候選PGT基因,繼而對(duì)其進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析,為后期基因的克隆及功能解析奠定基礎(chǔ)；(2)本實(shí)驗(yàn)成功克隆得到了6個(gè)候選PGT基因及1個(gè)已知的新疆紫草PGT基因,并分別命名為AePGT1、AePGT2、AePGT3、AePGT4、AePGT5、AePGT6、 AePGT。利用RF克隆技術(shù)成功將7個(gè)AePGTs(包括已經(jīng)報(bào)道的AePGT)構(gòu)建到pESC-His表達(dá)載體中,并且成功表達(dá)出相應(yīng)膜蛋白,繼而以GPP和PHBA為酶促反應(yīng)底物,進(jìn)行體外酶促反應(yīng),并通過(guò)酵母表達(dá)菌株發(fā)酵來(lái)證實(shí)體外酶促,結(jié)果表明AePGT4、AePGT6及AePGT具有催化GPP的香葉烯基轉(zhuǎn)移到PHBA上生成GBA的活性。通過(guò)上述研究,成功克隆并得到了能夠編碼具有催化功能PGT蛋白的基因,為闡釋酶的酶學(xué)學(xué)特性及紫草素生物合成途徑奠定基礎(chǔ)；(3)通過(guò)RT-PCR技術(shù),檢測(cè)AePGTs在紅色高產(chǎn)懸浮細(xì)胞系和白色低產(chǎn)懸浮細(xì)胞系、植株的地上部分和地下部分表達(dá)量的差異及茉莉酸甲酯(MeJA)處理對(duì)其表達(dá)量的影響,結(jié)果顯示在紫草素類化合物產(chǎn)量較高的新疆紫草紅色高產(chǎn)細(xì)胞系及植株的地下部分,AePGTs基因的整體表達(dá)量明顯高于白色低產(chǎn)系及植株的地上部分；并且MeJA處理后AePGTs基因的表達(dá)量也會(huì)明顯升高,且紅色細(xì)胞系中的增長(zhǎng)幅度顯著高于白色細(xì)胞系,這說(shuō)明新疆紫草PGT基因的表達(dá)量與紫草素類化合物的合成密切相關(guān),且呈正相關(guān)性；(4)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)與具有催化功能的PGT同源性較高的功能缺失蛋白AePGT2、AePGT3、 AePGT5的N端分別缺少約50-60個(gè)氨基酸。為驗(yàn)證該段序列的功能,本研究將缺失的N段序列與3條功能缺失基因的全長(zhǎng)序列通過(guò)合成的方式構(gòu)建嵌合基因,并通過(guò)外源表達(dá)成功獲得相應(yīng)嵌合蛋白,AePGT-Cp2、AePGT-Cp3、AePGT-Cp5,繼而進(jìn)行體外酶促反應(yīng),結(jié)果表明3個(gè)嵌合蛋白均能夠催化GPP和PHBA反應(yīng)生成GBA,推測(cè)導(dǎo)致3個(gè)同源蛋白功能缺失的原因是其缺失的N端序列中包含一段與底物結(jié)合有關(guān)的重要結(jié)構(gòu)域。(5)通過(guò)擬南芥原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn),對(duì)AePGT4、AePGT6及AePGT進(jìn)行業(yè)細(xì)胞定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3者均為非質(zhì)體膜蛋白；結(jié)合文獻(xiàn)及紫草素類化合物合成過(guò)程中各通路發(fā)生位置,推測(cè)PGT為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;Q946

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本文編號(hào)：1139202