本文關(guān)鍵詞：水稻稻瘟病抗性基因保守結(jié)構(gòu)的工程抗病性

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【摘要】：水稻是我國重要的糧食作物,水稻的產(chǎn)量關(guān)乎著國家的糧食安全。在水稻生長過程中,經(jīng)常會(huì)受到水稻病害的脅迫,影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。稻瘟病是水稻三大病害之一,可在水稻生長的任何時(shí)期發(fā)病,輕者使水稻減產(chǎn),嚴(yán)重時(shí)可以造成水稻的絕收。利用水稻稻瘟病抗性基因,使用基因工程手段獲得對(duì)稻瘟病具有廣譜、高效、持久抗性的品種(系),是防控稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一。研究表明,植物的抗性基因大多編碼CC/TIR-NB-LRR蛋白,通常是由C端的LRR識(shí)別效應(yīng)分子,從而使LRR結(jié)構(gòu)域與NB-ARC結(jié)構(gòu)域互作,改變核苷酸綁定區(qū)域的位置和構(gòu)象,從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)原始信號(hào),最后通過N端的CC結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)下游的免疫反應(yīng)。但是在對(duì)亞麻銹病抗性蛋白L6和L7的TIR結(jié)構(gòu)域研究中發(fā)現(xiàn),其TIR結(jié)構(gòu)域足夠觸發(fā)細(xì)胞死亡反應(yīng)和介導(dǎo)免疫反應(yīng)。同樣大麥白粉病抗性蛋白MLA10,其CC結(jié)構(gòu)域都含有一個(gè)高度保守的EDVID基序,單獨(dú)的CC結(jié)構(gòu)域或者包含CC結(jié)構(gòu)的MLA10片段,都可以產(chǎn)生免疫自激活現(xiàn)象。CC結(jié)構(gòu)域自激活現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為基因設(shè)計(jì)提供了一個(gè)新的思路。水稻稻瘟病抗性基因也是編碼CC/TIR-NB-LRR蛋白,但是從來沒有關(guān)于水稻稻瘟病抗性基因CC結(jié)構(gòu)域自激活的報(bào)道。前期通過大量查閱文獻(xiàn)和對(duì)水稻稻瘟病R基因序列分析,選取了7個(gè)編碼CC-NB-LRR蛋白,并且CC結(jié)構(gòu)域都含有一個(gè)高度保守EDVID基序的稻瘟病抗性基因作為研究對(duì)象。通過結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)獲得7個(gè)R基因的CC結(jié)構(gòu)域,在煙草和水稻原生質(zhì)體中表達(dá),只有Pi36基因的CC結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出了自激活現(xiàn)象,明顯能夠觸發(fā)細(xì)胞死亡反應(yīng)。在擬南芥中異源表達(dá)Pi36CC增強(qiáng)擬南芥對(duì)白粉病的抗性。本研究基于Pi36基因的CC結(jié)構(gòu)域自激活的特性,在水稻中單獨(dú)表達(dá)Pi36CC,研究其自激活與水稻免疫反應(yīng)的關(guān)系,揭示水稻稻瘟病抗性基因介導(dǎo)免疫反應(yīng)的機(jī)制,探索通過基因工程獲得廣譜稻瘟病抗性的新途徑。得到了以下結(jié)果：1、實(shí)驗(yàn)使用稻瘟病誘導(dǎo)性啟動(dòng)子PBZ1啟動(dòng)子,選取水稻稻瘟病抗性基因Pi36的CC結(jié)構(gòu)域Pi36CC(1-134aa),并且加入標(biāo)記基因GFP,成功的構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中,得到PBZ1::Pi36 CC(1-143)的水稻表達(dá)載體2、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻粳稻品種TP309遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得了含有PBZ1::Pi36 CC(1-143)水稻表達(dá)載體的To代陽性植株。在轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ锰镒匀粭l件繼代,并使用潮霉素篩選和目的基因PCR篩選的方法,得到了純合的轉(zhuǎn)基因種子。3、對(duì)轉(zhuǎn)基因陽性植株接種常見稻瘟病菌,轉(zhuǎn)基因水稻表現(xiàn)出明顯的稻瘟病抗性水平的提高。病斑數(shù)量和病斑大小的計(jì)數(shù)以及稻瘟病菌生物量和Pi36CC表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果一致表明,在稻瘟病菌的誘導(dǎo)下PBZ1啟動(dòng)子能夠啟動(dòng)Pi36CC的表達(dá),而且Pi36CC在水稻中表達(dá),能夠明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)稻瘟病的抗性。4、進(jìn)一步對(duì)抗性相關(guān)基因的表達(dá)量的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻抗性相關(guān)基因OsPR1a和OsPR5以及PTI相關(guān)基因KS4和NCA4表達(dá)量明顯提高。說明Pi36CC能夠通過介導(dǎo)抗性相關(guān)基因表達(dá)量的升高,從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻稻瘟病的抗性。并且Pi36CC介導(dǎo)的抗性增強(qiáng)還和PTI相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：水稻 稻瘟病 Pi36CC 工程抗病性
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S435.111.41
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-29
• 1.1 植物先天免疫機(jī)制研究進(jìn)展11-16
• 1.1.1 病原體相關(guān)分子模式觸發(fā)免疫系統(tǒng)(PTI)11-12
• 1.1.2 效應(yīng)分子激發(fā)免疫系統(tǒng)(ETI)12-14
• 1.1.3 植物獲得性免疫系統(tǒng)(SAR)14-15
• 1.1.4 植物HR反應(yīng)15-16
• 1.2 水稻抗性基因研究進(jìn)展16-19
• 1.2.1 水稻稻瘟病抗性基因的概述16-18
• 1.2.2 水稻稻瘟病無毒基因的概述18-19
• 1.3 植物抗病基因結(jié)構(gòu)和功能研究進(jìn)展19-23
• 1.3.1 植物R基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)19-20
• 1.3.2 植物NBS-LRR基因結(jié)構(gòu)與功能20-23
• 1.3.3 抗性蛋白免疫自激活23
• 1.4 植物誘導(dǎo)性啟動(dòng)子研究進(jìn)展23-26
• 1.4.1 植物病原因子誘導(dǎo)性啟動(dòng)子24-25
• 1.4.2 植物激素誘導(dǎo)性啟動(dòng)子25
• 1.4.3 植物理化因子誘導(dǎo)性啟動(dòng)子25-26
• 1.5 植物工程抗病性的探索26-28
• 1.5.1 病原物因子工程抗病性26-27
• 1.5.2 植物R基因工程抗病性27-28
• 1.6 立題依據(jù)和研究目的28-29
• 2 實(shí)驗(yàn)材料和方法29-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 2.1.1 水稻材料和稻瘟病菌株29
• 2.1.2 目的抗性基因29
• 2.1.3 表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化菌株29
• 2.1.4 常用實(shí)驗(yàn)試劑29-30
• 2.1.5 常用實(shí)驗(yàn)儀器30
• 2.1.6 常用培養(yǎng)基與配置30-31
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法31-41
• 2.2.1 植物表達(dá)載體構(gòu)建31-36
• 2.2.4 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌36-37
• 2.2.5 水稻遺傳轉(zhuǎn)化和陽性株篩選37-39
• 2.2.6 轉(zhuǎn)基因水稻稻瘟病抗性鑒定39-41
• 3 結(jié)果與分析41-47
• 3.1 前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果41
• 3.2 表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果41-43
• 3.3 轉(zhuǎn)基因水稻陽性植株的獲得43-44
• 3.4 轉(zhuǎn)基因水稻稻瘟病接種結(jié)果44-46
• 3.5 水稻抗性相關(guān)基因表達(dá)量的分析46-47
• 4 討論47-48
• 4.1 在水稻免疫系統(tǒng)中Pi36CC的功能47
• 4.2 抗性基因保守結(jié)構(gòu)域工程抗病性途徑47-48
• 5 后續(xù)研究設(shè)想48-50
• 參考文獻(xiàn)50-59
• 致謝59-60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 劉小紅,張紅偉,劉昕,劉欣潔,譚振波,榮廷昭;MDMV CP基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因玉米的研究[J];生物工程學(xué)報(bào);2005年01期

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本文編號(hào)：1105710