本文關鍵詞：三葉青擴展蛋白基因的克隆和塊根內(nèi)生真菌的分離鑒定及其分析

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【摘要】：三葉青(Tetrastigma hemsleyanum Diels Gilg ex Diels)為我國珍稀藥用植物,全株均可入藥,以球形塊根藥用價值最高；但自然條件下三葉青生長緩慢,目前已無法滿足市場的需求。擴展蛋白是一類普遍存在于植物細胞壁的蛋白質(zhì),不僅可以使細胞伸長生長,而且可以通過調(diào)節(jié)細胞壁柔韌性使其適應周圍環(huán)境;植物內(nèi)生真菌在自然界廣泛存在,且種類繁多,在長期的進化過程中,內(nèi)生真菌與宿主植物形成互惠互利的關系,內(nèi)生真菌既可以影響植物的生長發(fā)育,又可以提高植物的抗旱、抗鹽、抗病等抗逆性,并且對宿主植物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生具有影響作用。本研究首先克隆了三葉青擴展蛋白基因(Th-exp)全長cDNA序列；其次,分離鑒定了三葉青塊根中的內(nèi)生真菌并進行了細胞學觀察；最后,測定了接種內(nèi)生真菌發(fā)酵液的三葉青無菌苗中擴展蛋白基因表達量以及藥用活性成分總黃酮的含量。具體研究結(jié)果如下：(1)根據(jù)GenBank中登錄的擴展蛋白基因保守區(qū)域序列設計1對簡并引物,以三葉青球形塊根cDNA為模板進行PCR擴增,再結(jié)合RACE技術,獲得三葉青擴展蛋白基因全長cDNA序列(命名為Th-exp),共782 bp,其中包含630 bp開放閱讀框,編碼209個氨基酸(序列已被GenBank收錄,登錄號KP693606)。Th-exp編碼的蛋白質(zhì)具有典型的擴展蛋白結(jié)構(gòu)特征,N端含有8個半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域,C端含有4個保守的色氨酸結(jié)構(gòu)域,中間含有組氨酸功能域。Blast分析顯示,Th-exp與葡萄、醉蝶花中擴展蛋白基因具有相似性。半定量RT-PCR和熒光定量PCR分析表明,Th-exp基因在三葉青葉、莖、普通細根和球形塊根中均有表達,但球形塊根中表達強于其它器官。(2)采用組織塊分離法,從三葉青多年生塊根中共分離到31株內(nèi)生真菌,菌株顏色、質(zhì)地、生長速度等具有差異性。通過對內(nèi)生真菌的ITS rDNA序列進行擴增和分析,將分離到的內(nèi)生真菌歸于10個屬,分別是鐮刀菌屬、根盤菌屬、炭疽菌屬、柱孢屬、翅孢殼屬、青霉屬、小不整球殼屬、曲霉屬、鏈格孢屬、帚枝霉屬等；另有編號8.16-10-2菌株為未培養(yǎng)真菌(uncultured fungus),其中鐮刀菌屬為三葉青塊根中的優(yōu)勢菌屬。此外,制作三葉青多年生塊根石蠟切片,采用番紅-固綠法染色并觀察,結(jié)果顯示,三葉青內(nèi)生真菌多散亂分布于細胞皮層及韌皮部部位,定殖于宿主植物塊根的單個或多個連續(xù)的細胞中。(3)選取三葉青塊根中出現(xiàn)頻率較高菌屬真菌的發(fā)酵液添加到MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)三葉青無菌苗,熒光定量PCR檢測顯示,Th-9.7-1、Th-9.7-2、Th-11.23-1植株葉片中Th-exp基因均上調(diào)表達,其中,Th-9.7-2中表達量約是對照組的3倍多,差異性最大；而Th-8.16-8、Th-8.16-13-1中Th-exp基因的表達量降低；植株Th-9.7-5中該基因表達量無明顯變化。使用紫外分光光度計測定葉片中藥用成分總黃酮的含量,結(jié)果顯示,9.7-1、9.7-5、8.16-8、11.23-1菌株均可誘導三葉青黃酮含量的升高,其中Th-9.7-5植株含量高達39.6194 mg/g·DW,而Th-9.7-2、Th-8.16-13-]中黃酮含量與對照組無明顯差異。
【關鍵詞】：三葉青 擴展蛋白 內(nèi)生真菌 塊根 黃酮
【學位授予單位】：杭州師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S567.239;Q93
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 文獻綜述13-23
• 1 三葉青研究進展13-16
• 1.1 三葉青的人工繁殖13-14
• 1.2 三葉青的化學成分14
• 1.3 三葉青的藥理作用14-16
• 2 擴展蛋白基因研究進展16-18
• 2.1 擴展蛋白基因家族及蛋白結(jié)構(gòu)16-17
• 2.2 擴展蛋白與植物的抗逆性17-18
• 3 內(nèi)生真菌研究進展18-22
• 3.1 內(nèi)生真菌的物種普遍性與多樣性18-19
• 3.2 內(nèi)生真菌的生物學功能19-22
• 4 本研究的目的意義22-23
• 第二章 三葉青擴展蛋白基因的克隆和表達分析23-41
• 1 實驗材料與方法23-32
• 1.1 實驗材料23-24
• 1.2 擴展蛋白基因中間序列的克隆24-28
• 1.3 擴展蛋白基因5'端序列的克隆28-30
• 1.4 擴展蛋白基因3'端序列的克隆30
• 1.5 擴展蛋白基因全長cDNA的獲得30-31
• 1.6 擴展蛋白基因的生物信息學分析31
• 1.7 擴展蛋白基因的表達分析31-32
• 2 結(jié)果與分析32-39
• 2.1 擴展蛋白中間序列分析32-33
• 2.2 擴展蛋白5'端序列分析33-34
• 2.3 擴展蛋白3'端序列分析34-35
• 2.4 Th-exp基因全序列的獲得及生物信息學分析35-38
• 2.5 Th-exp基因的表達分析38-39
• 3 討論39-41
• 第三章 三葉青塊根內(nèi)生真菌分離鑒定及細胞學觀察41-53
• 1 實驗材料和方法41-45
• 1.1 實驗材料41
• 1.2 塊根內(nèi)生真菌的分離純化41-42
• 1.3 塊根內(nèi)生真菌的鑒定42-43
• 1.4 塊根內(nèi)生真菌的進化分析43
• 1.5 塊根內(nèi)生真菌的細胞學觀察43-45
• 2 結(jié)果與分析45-51
• 2.1 塊根內(nèi)生真菌的分離45-47
• 2.2 塊根內(nèi)生真菌的鑒定及進化分析47-51
• 2.3 菌根石蠟切片觀察51
• 3 討論51-53
• 第四章 三葉青內(nèi)生真菌對擴展蛋白基因表達及黃酮含量的影響53-61
• 1 實驗材料和方法53-55
• 1.1 實驗材料53-54
• 1.2 三葉青無菌苗的獲得54
• 1.3 三葉青無菌苗接種內(nèi)生真菌54
• 1.4 不同處理三葉青中Th-exp基因表達的測定54
• 1.5 不同處理三葉青中總黃酮含量的測定54-55
• 2 結(jié)果與分析55-59
• 2.1 三葉青無菌苗的獲得55-56
• 2.2 三葉青的生長情況56-57
• 2.3 不同處理三葉青中Th-exp基因表達分析57
• 2.4 不同處理三葉青中總黃酮含量的分析57-59
• 3 討論59-61
• 參考文獻61-69
• 附錄69-76
• 研究生期間的科研成果76

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本文編號：1080594