本文關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹(shù)HbJAZs基因的克隆與互作蛋白鑒定

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【摘要】：巴西橡膠樹(shù)(Hevea brasiliensis)是天然橡膠的主要來(lái)源。膠乳的產(chǎn)生和貯存主要通過(guò)乳管來(lái)進(jìn)行,對(duì)橡膠樹(shù)進(jìn)行機(jī)械損傷或外施茉莉酸都可以誘導(dǎo)乳管分化。茉莉酸是調(diào)控橡膠樹(shù)乳管分化重要的信號(hào)分子,而JAZ蛋白是茉莉酸信號(hào)途徑下游基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵的抑制因子,因此對(duì)JAZ蛋白的研究對(duì)于研究橡膠樹(shù)的乳管分化以及產(chǎn)膠機(jī)理有重大意義。本研究從以下幾個(gè)方面對(duì)橡膠樹(shù)JAZ蛋白進(jìn)行了研究：(1) 通過(guò)結(jié)合GenBank中已有的橡膠cDNA序列和本實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù),通過(guò)電子克隆的方法獲得5個(gè)橡膠JAZ基因全長(zhǎng)序列,并通過(guò)PCR技術(shù)成功擴(kuò)增得到HbJAZ3, HbJAZ5, HbJAZ6和HbJAZ12。其編碼區(qū)大小分別為852bp,786bp, 426bp和699bp。(2)利用實(shí)時(shí)定量PCR研究了HbJAZ3, HbJAZ5, HbJAZ6, HbJAZ12這四個(gè)基因在膠乳、葉片、莖尖、樹(shù)皮、雄蕊及雌蕊中的表達(dá)組織特異性,以及傷誘導(dǎo)、外施茉莉酸處理對(duì)這四個(gè)基因表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)HbJAZ3在雌蕊和雄蕊中表達(dá)量較高,HbJAZ5在樹(shù)皮中表達(dá)量最高,HbJAZ6在樹(shù)皮和雄蕊中表達(dá)量高,HbJAZ12在雌蕊中表達(dá)量最高。說(shuō)明這四種基因可能分別在這些組織中起重要作用。另外發(fā)現(xiàn)傷誘導(dǎo)均可以誘導(dǎo)這四種基因的表達(dá)。而茉莉酸處理可以誘導(dǎo)HbJAZ3和HbJAZ12的表達(dá),抑制HbJAZ4和HbJAZ6的表達(dá)。(3)構(gòu)建HbJAZ3,5,6,12的酵母雙雜誘餌以及捕獲載體,再加上已有的其余HbJAZs的酵母誘餌與捕獲載體,進(jìn)行HbJAZs蛋白之間的互作,發(fā)現(xiàn)HbJAZ2,5,6能夠形成同源二聚體互作,而HbJAZ1,2,3,5,6,8,9,10,11,12能夠與某個(gè)或幾個(gè)其余HbJAZ蛋白形成異源二聚體進(jìn)而互作。(4)將已有的所有HbJAZs的捕獲載體與實(shí)驗(yàn)室已有的HbCoil的誘餌載體進(jìn)行酵母雙雜互作,發(fā)現(xiàn)在添加冠菌素(Coronatine)的情況下,HbCoi1與HbJAZs中的HbJAZ8, HbJAZ9互作,而不與其余的HbJAZs互作,說(shuō)明在橡膠樹(shù)中,HbCoi1可能通過(guò)與HbJAZs蛋白互作調(diào)控下游信號(hào)。
【關(guān)鍵詞】：橡膠樹(shù) 茉莉酸 基因克隆 熒光定量PCR HbJAZs酵母雙雜互作
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S794.1
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 1 引言8-17
• 1.1 研究背景8
• 1.2 巴西橡膠樹(shù)簡(jiǎn)介以及橡膠樹(shù)乳管分化機(jī)制和膠乳產(chǎn)生途徑8-10
• 1.2.1 巴西橡膠樹(shù)簡(jiǎn)介8
• 1.2.2 橡膠樹(shù)乳管分化的研究8-9
• 1.2.3 巴西橡膠樹(shù)膠乳的生物合成9-10
• 1.3 植物茉莉酸信號(hào)途徑概述10-15
• 1.3.1 茉莉酸及其衍生物簡(jiǎn)介10
• 1.3.2 茉莉酸的生物合成10-11
• 1.3.3 茉莉酸的信號(hào)傳導(dǎo)途徑11-12
• 1.3.4 JAZ基因家族12-13
• 1.3.5 茉莉酸信號(hào)的受體13-14
• 1.3.6 茉莉酸在橡膠生物合成中的作用14-15
• 1.4 酵母雙雜技術(shù)15-16
• 1.4.1 酵母雙雜技術(shù)15
• 1.4.2 酵母雙雜技術(shù)原理15-16
• 1.4.3 酵母雙雜系統(tǒng)的構(gòu)建16
• 1.5 本研究的目的和意義16
• 1.6 本研究技術(shù)路線16-17
• 2 材料與方法17-31
• 2.1 材料與試劑17
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 2.1.2 試劑及工具17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-31
• 2.2.1 巴西橡膠HbJAZs基因的cDNA全長(zhǎng)克隆17-21
• 2.2.2 巴西橡膠HbJAZs基因熒光定量表達(dá)21-24
• 2.2.3 HbJAZs酵母雙雜載體構(gòu)建以及與HbCoil1蛋白和橡膠JAZ家族酵母雙雜互作24-31
• 3 結(jié)果與分析31-46
• 3.1 HbJAZ3,5,6,12的cDNA克隆以及分析31-35
• 3.1.1 HbJAZ3,5,6,12的cDNA克隆31
• 3.1.2 橡膠基因HbJAZ3,5,6,12的生物信息學(xué)分析31-34
• 3.1.3 HbJAZ3,5,6,12同源性以及蛋白序列分析34-35
• 3.2 HbJAZs熒光定量PCR分析35-39
• 3.2.1 橡膠樹(shù)葉片RNA提取35-36
• 3.2.2 熒光定量PCR36-39
• 3.3 HbJAZs之間的蛋白互作驗(yàn)證39-43
• 3.3.1 構(gòu)建HbJAZ3,5,6,12的誘餌以及捕獲載體39
• 3.3.2 酵母感受態(tài)的高效轉(zhuǎn)化39-40
• 3.3.3 酵母雙雜轉(zhuǎn)化40-43
• 3.4 HbJAZs與HbCoi1的蛋白互作驗(yàn)證43-46
• 3.4.1 HbJAZs的誘餌載體以及HbCoi1的捕獲載體的構(gòu)建43
• 3.4.2 酵母感受態(tài)的轉(zhuǎn)化43-44
• 3.4.3 酵母雙雜轉(zhuǎn)化44-46
• 4 討論46-49
• 4.1 HbJAZ3,5,6,12基因的克隆以及生物信息學(xué)分析46-47
• 4.2 HbJAZ3,5,6,12在橡膠樹(shù)中的表達(dá)分析47
• 4.3 HbJAZ蛋白之間的互作47-48
• 4.4 HbCoi1與HbJAZ蛋白之間的互作48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 附錄52-55
• 致謝55

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