本文關鍵詞：銀杏MYB家族基因的克隆及表達分析

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【摘要】：MYB基因是植物轉錄因子中超大基因家族之一,已被證實廣泛參與植物體的次生代謝調節(jié)、生物及非生物環(huán)境脅迫應答,對植物生長發(fā)育及花、葉等器官的形態(tài)建成有重要的調控作用。銀杏是我國特有的珍貴樹種,銀杏葉黃酮有著許多獨特的中藥藥理作用,尤其是在心腦血管疾病治療中有顯著的療效,而很多MYB基因對植物的黃酮代謝具有重要的調控作用。因此,本文以銀杏作為實驗材料,從中克隆了新的MYB基因,并初步探索了MYB基因在銀杏黃酮生物合成及其環(huán)境脅迫應答中的調控作用。主要研究結果如下:1結合植物中MYB基因DNA結合域的保守區(qū),利用Primer Premier 5.0設計特異性引物,采用RT-PCR和RACE技術,從銀杏中克隆出GbMYB1、GbMYB2和GbMYB3 3條新的MYB基因,其中GbMYB1全長1101 bp,包括249個氨基酸的開放閱讀框(OFR),其中OFR為750 bp;GbMYB2全長1278 bp,包括389個氨基酸的開放閱讀框(OFR),其中OFR為1170 bp;GbMYB3全長1442 bp,包括417個氨基酸的開放閱讀框(OFR),其中OFR為1254 bp。利用MEGA 5.0、DNAMAN等軟件構建MYB系統(tǒng)發(fā)育樹,分析發(fā)現(xiàn)GbMYB1和GbMYB2與蓖麻的RcMYB在進化上最相近,GbMYB3與裸子植物云杉的PtMYB在進化上最相近。通過氨基酸序列比對,發(fā)現(xiàn)這3條基因均具有兩個MYB結構域,屬于典型的R2R3-MYB基因。2以兩年生銀杏扦插苗為實驗材料,分別進行了鹽(NaCl)、脫落酸(ABA)和低溫(4℃)三種非生物脅迫處理。通過實時熒光定量PCR,檢測了三個GbMYB基因在不同環(huán)境脅迫處理下不同時間的表達特異性。結果顯示,當銀杏受到非生物脅迫時,GbMYB基因在銀杏體內表達明顯上調。而通過測量不同環(huán)境脅迫處理的不同時期的銀杏葉片總黃酮的含量,發(fā)現(xiàn)當銀杏受到非生物脅迫時,銀杏體內黃酮類化合物有一定的積累。由此,我們推測GbMYB基因可能參與銀杏黃酮代謝的調控。3利用gateway技術構建GbMYB基因的過表達載體,并將克隆出的GbMYB1、GbMYB2和GbMYB3基因轉入擬南芥中,進行基因的表達分析。結果表明,GbMYB基因的過表達影響植物的生長發(fā)育,轉基因的植株高明顯優(yōu)于野生型和空質粒對照。對轉基因擬南芥進行氯化鈉(NaCl)、脫落酸(ABA)和低溫(4℃)非生物脅迫處理,發(fā)現(xiàn)GbMYB1、GbMYB2和GbMYB3基因在擬南芥中表達,增強了擬南芥對氯化鈉(NaCl)高鹽非生物脅迫的耐性。
【關鍵詞】：銀杏 MYB轉錄因子 非生物脅迫 銀杏黃酮 基因表達調控
【學位授予單位】：南京林業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S792.95
【目錄】：

• 致謝3-4
• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻綜述10-19
• 1.1 銀杏簡介10
• 1.1.1 銀杏概述10
• 1.1.2 銀杏基因工程應用研究10
• 1.2 銀杏黃酮類化合物10-14
• 1.2.1 銀杏葉黃酮類化合物成分10-11
• 1.2.2 銀杏黃酮類化合物的作用11
• 1.2.3 銀杏黃酮類化合物生物合成代謝途徑11-13
• 1.2.4 環(huán)境因素對銀杏黃酮合成的影響13-14
• 1.3 植物MYB轉錄因子研究14-17
• 1.3.1 植物MYB轉錄因子的特征與分類14-15
• 1.3.2 植物MYB轉錄因子的起源與進化15
• 1.3.3 植物MYB轉錄因子的功能15-17
• 1.4 目的與意義17-18
• 1.5 本課題研究的主要內容及目標18-19
• 1.5.1 研究目標18
• 1.5.2 研究內容18-19
• 第二章 銀杏MYB轉錄因子基因的克隆19-35
• 2.1 試驗材料19-20
• 2.1.1 植物材料19
• 2.1.2 菌種19
• 2.1.3 載體19
• 2.1.4 酶與試劑19
• 2.1.5 其他試劑19
• 2.1.6 溶液19
• 2.1.7 培養(yǎng)基19-20
• 2.1.8 主要儀器20
• 2.2 試驗方法20-29
• 2.2.1 銀杏葉總RNA的提取20-21
• 2.2.2 總RNA的檢測及純化21
• 2.2.3 cDNA的合成21-22
• 2.2.4 銀杏MYB基因兩端序列的擴增22-23
• 2.2.5 銀杏MYB基因的 3' RACE克隆23-24
• 2.2.6 銀杏MYB基因的 5' RACE克隆24-26
• 2.2.7 目的片段的凝膠回收和純化26
• 2.2.8 目的片段與克隆載體的連接26-27
• 2.2.9 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化27
• 2.2.10 陽性克隆菌株的篩選27-28
• 2.2.11 銀杏MYB基因全長cDNA的擴增28-29
• 2.3 試驗結果29-33
• 2.3.1 銀杏葉總RNA的提取29
• 2.3.2 MYB基因的克隆29-30
• 2.3.3 銀杏葉MYB基因全長cDNA全長序列的獲得30
• 2.3.4 銀杏葉MYB基因全長cDNA序列30
• 2.3.5 銀杏MYB基因的OFR分析30-31
• 2.3.6 銀杏MYB基因的BLAST比對分析31-32
• 2.3.7 銀杏MYB基因氨基酸序列的分析32-33
• 2.3.8 銀杏MYB基因的進化樹分析33
• 2.4 結果討論33-35
• 第三章 不同環(huán)境條件下銀杏MYB基因定量表達分析35-40
• 3.1 實驗材料與設備35
• 3.1.1 植物材料及其處理35
• 3.1.2 實驗試劑35
• 3.1.3 儀器35
• 3.2 試驗方法35-37
• 3.2.1 RNA提取、純化及cDNA的合成35
• 3.2.2 實時熒光定量PCR引物設計35-36
• 3.2.3 實時定量RT-PCR36
• 3.2.4 銀杏葉總黃酮的的提取36
• 3.2.5 銀杏葉總黃酮的的測定36-37
• 3.3 結果與分析37-39
• 3.3.1 內參基因GAPDH的篩選37
• 3.3.2 銀杏MYB基因在不同環(huán)境脅迫處理的表達分析37-38
• 3.3.3 銀杏不同脅迫處理后總黃酮的檢測38-39
• 3.4 討論39-40
• 第四章 銀杏MYB基因的表達載體構建及遺傳轉化40-48
• 4.1 試驗材料40
• 4.1.1 植物材料40
• 4.1.2 菌株及載體40
• 4.2 試驗方法40-46
• 4.2.1 銀杏MYB基因gateway表達載體的構建40-44
• 4.2.2 農桿菌介導的遺傳轉化44-45
• 4.2.3 轉基因擬南芥植株的陽性篩選45-46
• 4.3 結果分析46-47
• 4.3.1 銀杏MYB基因與TOPO載體入門克隆陽性重組子檢測46
• 4.3.2 銀杏MYB基因表達載體陽性重組子檢測46
• 4.3.3 轉基因擬南芥的初步檢測46-47
• 4.4 討論47-48
• 第五章 GBMYB1、GBMYB2和GBMYB3基因在擬南芥中的表達及相關功能分析48-52
• 5.1 實驗材料48
• 5.2 試驗方法48-49
• 5.2.1 T3代純合轉基因擬南芥植株的獲得48
• 5.2.2 轉基因植株表型的觀察48-49
• 5.3 結果與分析49-51
• 5.3.1 T3代轉基因純合植株株高表型的觀察49-50
• 5.3.2 轉基因擬南芥對非生物脅迫的抗性分析50-51
• 5.4 結果分析51-52
• 第六章 結論與展望52-54
• 6.1 主要結論52
• 6.2 展望52-54
• 參考文獻54-58
• 附表58-61

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 汪貴斌;郭旭琴;常麗;曹福亮;;溫度和土壤水分對銀杏葉黃酮類化合物積累的影響[J];應用生態(tài)學報;2013年11期

2 陳雷;常麗;曹福亮;汪貴斌;董曉偉;;銀杏葉黃酮類化合物含量及相關酶活性對溫度和干旱脅迫的響應[J];西北植物學報;2013年04期

3 朱燦燦;田亞玲;曹福亮;汪貴斌;;干旱脅迫對銀杏葉類黃酮年動態(tài)變化的影響[J];林業(yè)科技開發(fā);2010年04期

4 陳西娟;王成章;葉建中;;銀杏葉化學成分及其應用研究進展[J];生物質化學工程;2008年04期

5 董雯雯;孫洪賓;劉振學;;銀杏葉黃酮類化合物的研究進展[J];山東化工;2008年01期

6 樓崇;姚志剛;張往祥;汪貴斌;;生態(tài)因子對銀杏葉產量和黃酮含量的影響[J];華東森林經理;2006年03期

7 楊致榮,王興春,李西明,楊長登;高等植物轉錄因子的研究進展[J];遺傳;2004年03期

8 羅蘭,袁忠林;銀杏黃酮類化合物提取分離和分析方法研究進展[J];萊陽農學院學報;2003年04期

9 王華田,謝寶東,姜岳忠,王明林;光照強度對銀杏葉片發(fā)育及黃酮和內酯含量的影響[J];江西農業(yè)大學學報(自然科學);2002年05期

10 謝寶東,王華田,常立華,姜福成;土壤水分含量對銀杏葉黃酮和內酯含量的影響[J];山東林業(yè)科技;2002年04期

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本文編號：1064470