本文關(guān)鍵詞：番茄SlMADS23-like基因的克隆及功能研究

  更多相關(guān)文章： MADS-box基因 番茄 SlMADS23-like 葉綠素 非生物脅迫

【摘要】：番茄是茄科一年生草本植物在新鮮果蔬以及加工產(chǎn)業(yè)中是一種重要的模式作物。由于番茄生長周期短,表型易觀察,基因組相對較小并且像其他茄科植物一樣存在相同的保守的基因組結(jié)構(gòu),因此它被認(rèn)為是茄科植物研究果實的一個代表性的種類。MADS-box基因作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在生物體中的不同部位以及不同生長發(fā)育階段都有不同程度的表達(dá)。在動物中與心肌發(fā)育有關(guān);在真菌中起信息素應(yīng)答作用;在植物中調(diào)控花器官的形成及發(fā)育,開花時間,果實成熟及脫落,根、莖、葉的發(fā)育,同時MADS-box轉(zhuǎn)錄因子也參與植物的抗逆過程。本研究通過NCBI數(shù)據(jù)庫對基因篩選,分離并克隆出番茄SlMADS23-like基因,進(jìn)而開展了番茄SlMADS23-like基因的生物信息學(xué)分析,組織特異性分析,沉默轉(zhuǎn)基因番茄的培育等研究,其研究內(nèi)容及獲得的主要結(jié)果如下:1.生物信息學(xué)分析:該基因的開放閱讀框為720bp,編碼239個氨基酸,分子量為27.596kD,等電點為9.84。SlMADS23-like蛋白的疏水的平均值(GRAVY):-0.804,脂溶指數(shù)(aliphatic index)為86.86,表明SlMADS23-like蛋白為親水性脂溶蛋白。其不穩(wěn)定系數(shù)預(yù)測為55.51,因此推被定為是不穩(wěn)定的蛋白。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測52.30%的α螺旋,6.28%的β折疊,25.10%的無規(guī)則卷曲以及16.32%的延伸鏈。亞細(xì)胞定位預(yù)測SlMADS23-like屬于跨膜蛋白。2、以番茄的看家基因SlCAC(登錄號:SGN-U314153)作內(nèi)參,采用實時熒光定量PCR方法檢測SlMADS23-like基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示,該基因在番茄的各個組織中均有表達(dá),尤其在幼葉,成熟葉以及青果時期(IMG,MG)表達(dá)量比較高,但在果實成熟的各時期表達(dá)量比較低,并呈現(xiàn)出一個表達(dá)量下降的趨勢。3、為了進(jìn)一步揭示該基因的生物學(xué)功能,構(gòu)建了SlMADS23-like基因的沉默載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其成功導(dǎo)入到野生型番茄中,進(jìn)而通過NPTⅡ陽性菌株的檢測和實時定量RT-PCR技術(shù),獲得了3個沉默效率達(dá)到90%以上的沉默轉(zhuǎn)基因的番茄株系。4、SlMADS23-like基因沉默株系呈現(xiàn)的表型為:轉(zhuǎn)基因株系的成熟葉片(ML)以及青果時期的果實(IMG、MG)與野生型相比綠色變淺,為驗證這一表型,我們測定了成熟葉以及青果(IMG、MG)的葉綠素的含量,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系與野生型相比,其成熟葉以及青果(IMG、MG)中的葉綠素含量降低。對葉綠素相關(guān)的基因(DCL、GLK1、GLK2)的表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因株系的青果(IMG、MG)與野生型相比,這幾個基因的表達(dá)明顯下調(diào)。5、非生物脅迫(鹽處理,脫水處理,高低溫處理):在鹽處理中,該基因在根中表達(dá)量非常低,但在葉片中表達(dá)量較高;高溫誘導(dǎo)時,SlMADS23-like的表達(dá)量在12h達(dá)到最高值,而在低溫誘導(dǎo)時,SlMADS23-like的表達(dá)量在24h達(dá)到最大;脫水處理時,SlMADS23-like的表達(dá)量在4h的時候達(dá)到最高,之后到8h有小幅度的下調(diào),而后在8h-24h又有明顯上升的趨勢。也就是說,除鹽處理中SlMADS23-like在葉片中的表達(dá)基本沒有受到誘導(dǎo)之外,其他處理都對SlMADS23-like的表達(dá)有不同程度的誘導(dǎo)作用,其中葉鹽誘導(dǎo)和冷處理尤為明顯。在對幼苗發(fā)芽敏感性實驗中,轉(zhuǎn)基因株系要比野生型對ABA敏感,而在鹽溶液的敏感性則相反。我們通過以上結(jié)果可以猜測SlMADS23-like轉(zhuǎn)基因株系極可能存在抗逆性。6、選取沉默效率達(dá)90%以上的兩個株系分別進(jìn)行了鹽脅迫和冷處理。觀察到RNAi3-3,RNAi4-1與野生型相比均表現(xiàn)出抗鹽、抗冷的表型,為進(jìn)一步驗證這個表型,我們檢測了鹽脅迫相關(guān)基因(PR1、PR5、CAT1、CAT2、ER5、TAS14等)和與冷處理相關(guān)的基因Cat2、CBF1和Cor)在分子水平上的變化,結(jié)果表明,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因株系中鹽脅迫相關(guān)基因(PR1、PR5、CAT1、CAT2、ER5、TAS14等)表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的上調(diào),而冷處理相關(guān)的基因(Cat2、CBF1和Cor)表達(dá)則均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)。綜上所述,本研究通過對番茄SlMADS23-like基因在番茄中的功能及其分子調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了探究與分析,發(fā)現(xiàn)SlMADS23-like基因可能在番茄中對葉綠素合成途徑有調(diào)控作用,同時我們對SlMADS23-like基因的非生物脅迫響應(yīng)中的功能和機(jī)制進(jìn)行了初步的探索和分析,這對全面闡明SlMADS23-like基因在植物中的功能和機(jī)理以及日后它們可能在基因工程中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：MADS-box基因 番茄 SlMADS23-like 葉綠素 非生物脅迫
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 縮略詞表11-12
• 1 緒論12-26
• 1.1 課題的國內(nèi)外研究進(jìn)展12-21
• 1.1.1 MADS-box基因的分布12
• 1.1.2 MADS-box基因的命名12-13
• 1.1.3 MADS-box基因的分類及結(jié)構(gòu)13-14
• 1.1.4 MADS-box基因的功能14-19
• 1.1.5 番茄中MADS-box基因的研究19-21
• 1.2 植物非生物脅迫21-22
• 1.3 植物非生物脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的研究22-23
• 1.4 MADS-box基因在植物抗逆性中的研究23
• 1.5 課題研究的提出和研究意義23-24
• 1.6 研究內(nèi)容與技術(shù)路線24-25
• 1.6.1 研究內(nèi)容24-25
• 1.6.2 技術(shù)路線25
• 1.7 課題的創(chuàng)新點25-26
• 2 SlMADS23-like基因的克隆26-38
• 2.1 實驗材料、試劑26-29
• 2.1.1 材料26
• 2.1.2 試劑26-29
• 2.2 儀器與設(shè)備29
• 2.3 方法29-35
• 2.3.1 番茄總RNA的提取29-30
• 2.3.2 cDNA的合成30-31
• 2.3.3 SlMADS23-like基因的引物設(shè)計31
• 2.3.4 SlMADS23-like基因的片段擴(kuò)增及純化31-32
• 2.3.5 SlMADS23-like基因與連接T載體32-35
• 2.4 結(jié)果與分析35-37
• 2.4.1 SlMADS23-like基因的片段擴(kuò)增35-36
• 2.4.2 pMD18-T-SlMADS23-like重組子的篩選及驗證36
• 2.4.3 SlMADS23-like基因片段測序36-37
• 2.5 小結(jié)37-38
• 3 SlMADS23-like基因的生物信息學(xué)分析38-46
• 3.1 方法38
• 3.1.1 SlMADS23-like蛋白的一級結(jié)構(gòu)38
• 3.1.2 SlMADS23-like蛋白的二級結(jié)構(gòu)38
• 3.1.3 SlMADS23-like蛋白的理化分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測38
• 3.1.4 SlMADS23-like與其他MADS-box蛋白的序列比對38
• 3.1.5 SlMADS23-like的進(jìn)化樹分析38
• 3.2 結(jié)果與分析38-44
• 3.2.1 SlMADS23-like蛋白的一級結(jié)構(gòu)38-41
• 3.2.2 SlMADS23-like蛋白的二級結(jié)構(gòu)41
• 3.2.3 SlMADS23-like蛋白的理化性質(zhì)分析41-42
• 3.2.4 SlMADS23-like蛋白與其他MADS-box蛋白的同源比對42-43
• 3.2.5 SlMADS23-like蛋白與其他MADS-box蛋白的進(jìn)化樹分析43-44
• 3.3 小結(jié)44-46
• 4 SlMADS23-like基因的表達(dá)模式分析46-50
• 4.1 材料和試劑46
• 4.1.1 材料46
• 4.1.2 試劑46
• 4.2 儀器46
• 4.3 方法46-47
• 4.3.1 植物組織樣品的收集46-47
• 4.3.2 番茄總RNA的提取47
• 4.3.3 SlMADS23-like基因的q RT-PCR引物的設(shè)計47
• 4.3.4 SlMADS23-like基因的表達(dá)模式分析47
• 4.4 SlMADS23-like基因在番茄組織中的表達(dá)模式分析47-48
• 4.5 小結(jié)48-50
• 5 SlMADS23-like基因的RNAi沉默載體的構(gòu)建50-62
• 5.1 材料50-52
• 5.2 儀器和設(shè)備52
• 5.3 方法52-58
• 5.3.1 SlMADS23-like基因沉默載體的構(gòu)建52
• 5.3.2 SlMADS23-like基因沉默片段的克隆52-53
• 5.3.3 pHANNIBAL-SlMADS23-likei載體的構(gòu)建53-56
• 5.3.4 pBIN19-SlMADS23-likei沉默終載體的構(gòu)建56-58
• 5.4 結(jié)果與分析58-61
• 5.4.1 pHANNIBAL-SlMADS23-likei載體的構(gòu)建58-60
• 5.4.2 pBIN19-SlMADS23-likei沉默終載體的構(gòu)建60-61
• 5.5 小結(jié)61-62
• 6 SlMADS23-like基因RNAi沉默載體轉(zhuǎn)化62-74
• 6.1 材料、試劑和培養(yǎng)基62-65
• 6.1.1 材料62
• 6.1.2 試劑62-63
• 6.1.3 實驗所用的培養(yǎng)基63-65
• 6.2 儀器設(shè)備65-66
• 6.3 方法66-71
• 6.3.1 RNAi沉默菌株和農(nóng)桿菌的結(jié)合轉(zhuǎn)移66-67
• 6.3.2 SlMADS23-like基因沉默載體轉(zhuǎn)化番茄67-68
• 6.3.3 SlMADS23-like基因沉默的轉(zhuǎn)基因番茄的培養(yǎng)68-69
• 6.3.4 SlMADS23-like基因陽性沉默的轉(zhuǎn)基因番茄株系的PCR篩選69-70
• 6.3.5 SlMADS23-like基因在沉默轉(zhuǎn)基因番茄株系中的表達(dá)檢測及篩選70-71
• 6.4 結(jié)果與分析71-73
• 6.4.1 培育SlMADS23-like基因沉默轉(zhuǎn)基因番茄株系71
• 6.4.2 SlMADS23-like基因陽性沉默轉(zhuǎn)基因番茄株系的PCR篩選71-72
• 6.4.3 SlMADS23-like基因在沉默轉(zhuǎn)基因番茄株系中的表達(dá)檢測72-73
• 6.5 小結(jié)73-74
• 7 SlMADS23-like在番茄中RNAi沉默株系的表型觀察及分析74-80
• 7.1 材料與試劑74
• 7.1.1 材料74
• 7.1.2 試劑74
• 7.2 儀器與設(shè)備74
• 7.3 方法74-75
• 7.3.1 SlMADS23-like基因沉默轉(zhuǎn)基因番茄葉片的表型及葉片葉綠素含量的測定74-75
• 7.3.2 SlMADS23-like基因沉默轉(zhuǎn)基因番茄青果時期的表型及青果時期葉綠素含量的測定75
• 7.3.3 SlMADS23-like基因沉默轉(zhuǎn)基因番茄青果時期葉綠素相關(guān)基因檢測75
• 7.4 結(jié)果與分析75-78
• 7.4.1 SlMADS23-like基因轉(zhuǎn)基因番茄葉片的表型及葉片葉綠素含量的測定75-76
• 7.4.2 SlMADS23-like基因轉(zhuǎn)基因番茄青果時期的表型及青果時期葉綠素含量的測定76-77
• 7.4.3 SlMADS23-like基因轉(zhuǎn)基因番茄青果時期葉綠素相關(guān)基因檢測77-78
• 7.5 小結(jié)78-80
• 8 SlMADS23-like基因的非生物脅迫實驗設(shè)計及分析80-94
• 8.1 材料和方法80-84
• 8.1.1 材料80
• 8.1.2 試劑80
• 8.1.3 SlMADS23-like基因在AC中的非生物脅迫處理實驗80
• 8.1.4 SlMADS23-like基因的種子在ABA下的發(fā)芽率80-81
• 8.1.5 SlMADS23-like基因發(fā)芽種子對鹽脅迫和ABA敏感度的實驗81
• 8.1.6 SlMADS23-like基因轉(zhuǎn)基因植株的非生物脅迫處理實驗81-84
• 8.2 結(jié)果與分析84-92
• 8.2.1 SlMADS23-like基因在AC中的非生物脅迫處理實驗84-85
• 8.2.2 SlMADS23-like基因的種子在ABA下的發(fā)芽率85
• 8.2.3 SlMADS23-like基因幼苗對鹽脅迫和ABA敏感度的實驗85-87
• 8.2.4 SlMADS23-like基因轉(zhuǎn)基因植株的非生物脅迫處理實驗87-92
• 8.3 小結(jié)92-94
• 9 討論94-98
• 9.1 SlMADS23-like在番茄中參與調(diào)節(jié)葉片與青果時期的葉綠素積累量的功能94
• 9.2 SlMADS23-like轉(zhuǎn)基因幼苗對ABA與鹽溶液的敏感性研究94-95
• 9.3 SlMADS23-like基因在非生物脅迫中的功能95
• 9.4 SlMADS23-like可能參與調(diào)控多個脅迫相關(guān)基因的表達(dá)95-98
• 10 結(jié)論與展望98-100
• 10.1 結(jié)論98-99
• 10.2 展望99-100
• 致謝100-102
• 參考文獻(xiàn)102-114
• 附錄114
• A. 作者碩士期間發(fā)表的論文114
• B. 作者在攻讀碩士學(xué)位期間參與的科研項目114

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