發(fā)布時(shí)間：2017-10-17 22:00

  本文關(guān)鍵詞：菜心硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRTs的克隆及其表達(dá)特性分析

  更多相關(guān)文章： 菜心 氮素吸收 銨硝配比 NRTs基因 硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

【摘要】：近幾年隨著蔬菜栽培中氮肥施用量的增加,蔬菜硝酸鹽積累與氮素利用率降低的問題逐漸突出。硝態(tài)氮是植物吸收的主要氮源,根系對(duì)硝態(tài)氮的吸收主要是通過硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT進(jìn)行的,其主要代表是低親和硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1和高親和硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT2。NRT對(duì)硝態(tài)氮的吸收能力主要取決于其對(duì)硝態(tài)氮的親和性,同時(shí)也受外界環(huán)境的影響。菜心(Brassica campestrisL.ssp.chinesis var.utilisTsen et Lee)是華南地區(qū)特產(chǎn)和栽培面積最大的蔬菜,是一種喜硝態(tài)氮的葉類蔬菜。目前關(guān)于菜心氮素吸收分子機(jī)理的研究較少,研究菜心氮素吸收規(guī)律及其與NRTs表達(dá)特性的相關(guān)性,對(duì)于揭示硝酸鹽積累的分子機(jī)制具有重要意義。本試驗(yàn)在水培條件下對(duì)菜心氮素吸收能力以及NRTs基因表達(dá)進(jìn)行研究。研究?jī)?nèi)容分為以下四個(gè)方面:(1)菜心硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因BcNRT1;1,BcNRT1;2和BcNRT2;1的克隆與功能分析;(2)不同生長(zhǎng)時(shí)期菜心的氮素吸收能力與NRTs基因表達(dá)特性分析;(3)不同氮源處理對(duì)菜心氮素吸收以及根系NRTs基因表達(dá)的影響;(4)銨硝混合條件下菜心的氮素吸收特性與NRTs基因表達(dá)特性分析。主要結(jié)果如下:1.利用RT-PCR法克隆得到了菜心BcNRT1;1,BcNRT1;2和BcNRT2;1三個(gè)硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,其ORF全長(zhǎng)分別為1770bp,1638bp和1530bp。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明BcNRT1;1和BcNRT1;2隸屬于低親和硝轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),BcNRT2;1隸屬于高親和硝轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。對(duì)BcNRT1;1,BcNRT1;2和BcNRT2;1編碼的氨基酸序列分析表明,BcNRT1;1編碼的氨基酸殘基數(shù)為589個(gè),相對(duì)分子質(zhì)量為64.97kD,理論等電點(diǎn)為8.44,蛋白平均疏水性0.353;而BcNRT1;2的編碼的氨基酸殘基數(shù)為545個(gè),相對(duì)分子質(zhì)量為61.55kD,理論等電點(diǎn)為8.80,蛋白平均疏水性0.321;BcNRT2;1編碼的氨基酸殘基數(shù)為510個(gè),相對(duì)分子質(zhì)量為55.55kD,理論等電點(diǎn)為9.11,蛋白平均疏水性0.373。2.不同生長(zhǎng)時(shí)期菜心對(duì)硝態(tài)氮的吸收能力具有顯著差異,抽薹初期硝態(tài)氮吸收能力最強(qiáng)。BcNRT1;1主要在根系中表達(dá),其在根系和葉片中的表達(dá)均是先上升后下降;BcNRT1;2營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期在根系的表達(dá)量高于葉片,從抽薹初期開始,葉片的表達(dá)量超過根系。BcNRT2;1主要在根系中表達(dá),其在根系中的表達(dá)隨著生長(zhǎng)時(shí)期先上升后下降,而葉片的表達(dá)量則是一直下降。不同生長(zhǎng)時(shí)期菜心硝態(tài)氮吸收能力與根系中BcNRT1;1的表達(dá)量具有顯著相關(guān)性,為0.778。3.菜心對(duì)硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的吸收具有不同的特性。菜心對(duì)NO_3~-的吸收隨著營(yíng)養(yǎng)液硝態(tài)氮濃度的增加而增加,菜心植株總氮含量也隨著硝態(tài)氮濃度的增加而增加。菜心對(duì)NH_4~+的吸收隨著營(yíng)養(yǎng)液銨態(tài)氮濃度的增加而有少量的增加,但是在銨態(tài)氮濃度低于2mM及高于4mM條件時(shí)對(duì)銨的吸收不隨濃度的變化而出現(xiàn)顯著的差異。在1~8mM的銨態(tài)氮濃度條件下菜心總氮含量沒有顯著差異。菜心三個(gè)NRTs基因的表達(dá)均受硝態(tài)氮誘導(dǎo),BcNRT1;1與BcNRT1;2的被誘導(dǎo)幅度隨著硝態(tài)氮濃度的增加而增加,而BcNRT2;1則相反。低濃度的銨態(tài)氮對(duì)BcNRT1;1與BcNRT1;2基因表達(dá)有誘導(dǎo)作用,但是隨著銨態(tài)氮濃度的增加這種誘導(dǎo)作用減弱。銨態(tài)氮對(duì)菜心根系BcNRT2;1基因表達(dá)主要起抑制作用。4.銨硝比0:100、25:75和50:50三個(gè)處理中,銨硝比25:75的處理植株對(duì)總氮的吸收量顯著高于另外兩個(gè)處理。本試驗(yàn)中根系BcNRT1;1的表達(dá)量與菜心總氮吸收呈正相關(guān)關(guān)系,吸收24h的相關(guān)系數(shù)是0.919;BcNRT2;1表達(dá)與硝態(tài)氮吸收量關(guān)系更大,吸收24h的相關(guān)系數(shù)是0.863,而BcNRT1;2的表達(dá)量變化與氮素吸收量之間則沒有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。5.銨硝比25:75與25:100兩個(gè)處理在銨含量不變的情況下減少硝的含量,結(jié)果兩個(gè)處理中菜心對(duì)硝態(tài)氮的吸收量沒有發(fā)生顯著的變化。0:100與25:100兩個(gè)處理,在硝態(tài)氮含量不變的情況下銨的加入顯著地抑制了植株對(duì)硝的吸收。綜上所述,適量增銨促進(jìn)菜心植株總氮吸收的升高,主要是適當(dāng)比例銨硝混合(25:75)條件下菜心對(duì)銨的吸收補(bǔ)償了對(duì)硝吸收的減少,造成總氮吸收的顯著增加。不同處理中根系BcNRT1;1的表達(dá)量與菜心總氮吸收相關(guān)性最大。
【關(guān)鍵詞】：菜心 氮素吸收 銨硝配比 NRTs基因 硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S634.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 縮略詞表8-12
• 1 前言12-23
• 1.1 植物氮素營(yíng)養(yǎng)概述12-13
• 1.2 植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收及調(diào)控機(jī)制13-19
• 1.2.1 植物對(duì)NO_3~-的吸收過程13-14
• 1.2.2 低親和NO_3~-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因14-15
• 1.2.3 高親和NO_3~-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因15-17
• 1.2.4 植物硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)調(diào)控17-19
• 1.3 植物吸收銨態(tài)氮的生理和分子機(jī)理19-20
• 1.3.1 植物對(duì)NH_4~+的吸收過程19-20
• 1.4 植物對(duì)銨硝混合營(yíng)養(yǎng)的吸收利用20-21
• 1.4.1 銨硝混合營(yíng)養(yǎng)對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的影響20
• 1.4.2 增銨條件下的氮素吸收20-21
• 1.5 本研究的目的和意義21-23
• 2 材料與方法23-33
• 2.1 菜心硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRTs的克隆與生物信息學(xué)分析23-27
• 2.1.1 材料23
• 2.1.2 菜心RNA提取與cDNA第一鏈的合成23-24
• 2.1.3 目的基因片段的PCR擴(kuò)增24-26
• 2.1.4 目的片段的回收純化26
• 2.1.5 宿主菌E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞的制備26
• 2.1.6 目的片段與載體的連接26-27
• 2.1.7 測(cè)序27
• 2.1.8 生物信息學(xué)分析27
• 2.2 菜心不同生長(zhǎng)時(shí)期根系硝態(tài)氮吸收能力與NRTs基因表達(dá)特性27-29
• 2.2.1 材料27-28
• 2.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量28
• 2.2.3 硝態(tài)氮吸收量測(cè)定28-29
• 2.3 不同氮源處理對(duì)菜心氮素吸收及NRTs基因表達(dá)的影響29-30
• 2.3.1 材料29
• 2.3.2 不同形態(tài)和濃度氮素處理29
• 2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量29
• 2.3.4 菜心氮素吸收能力測(cè)定29-30
• 2.3.5 菜心植株全氮含量的測(cè)定30
• 2.4 不同銨硝配比對(duì)菜心氮素吸收與NRTs基因表達(dá)的影響30-31
• 2.4.1 材料30
• 2.4.2 不同銨硝配比處理30-31
• 2.4.3 營(yíng)養(yǎng)液含量氮素測(cè)定31
• 2.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量31
• 2.5 等銨減硝及等硝增銨對(duì)菜心氮素吸收與NRTs基因表達(dá)的影響31-33
• 2.5.1 材料31
• 2.5.2 等銨減硝及等硝增銨試驗(yàn)處理31-32
• 2.5.3 營(yíng)養(yǎng)液含量氮素測(cè)定32
• 2.5.4 熒光定量32-33
• 3 結(jié)果與分析33-59
• 3.1 菜心硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRTs的克隆與生物信息學(xué)分析33-39
• 3.1.1 BcNRT1;1，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 的克隆33-34
• 3.1.2 BcNRT1;1，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 陽性克隆的鑒定34
• 3.1.3 BcNRT1;1，，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 核苷酸序列分析34
• 3.1.4 BcNRT1;1，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 基因及推導(dǎo)氨基酸序列分析34-36
• 3.1.5 BcNRT1;1，BcNRT1;2 和BcNRT2;1 的蛋白結(jié)構(gòu)分析36-39
• 3.2 菜心不同生長(zhǎng)時(shí)期硝態(tài)氮吸收能力與NRTs基因表達(dá)特性39-42
• 3.2.1 菜心不同生長(zhǎng)時(shí)期根系重量與硝態(tài)氮吸收能力39-40
• 3.2.2 菜心不同生長(zhǎng)時(shí)期根系與葉片中NRTs基因表達(dá)情況40-42
• 3.3 不同氮源處理對(duì)菜心氮素吸收及NRTs基因表達(dá)的影響42-49
• 3.3.1 菜心對(duì)不同濃度硝態(tài)氮的吸收42-43
• 3.3.2 不同濃度硝態(tài)氮條件下NRTs基因的表達(dá)43-45
• 3.3.3 不同濃度硝態(tài)氮條件下菜心總氮含量45
• 3.3.4 菜心對(duì)不同濃度銨態(tài)氮的吸收45-47
• 3.3.5 不同濃度銨態(tài)氮條件下NRTs基因的表達(dá)47-49
• 3.3.6 不同濃度銨態(tài)氮條件下菜心總氮含量49
• 3.4 不同銨硝配比對(duì)菜心氮素吸收與NRTs基因表達(dá)的影響49-52
• 3.4.1 不同銨硝配比對(duì)菜心氮素吸收49-50
• 3.4.2 不同銨硝配比對(duì)菜心NRTs基因表達(dá)的影響50-52
• 3.5 等銨減硝及等硝增銨對(duì)菜心氮素吸收與NRTs基因表達(dá)的影響52-59
• 3.5.1 等銨減硝條件下菜心氮素吸收52-53
• 3.5.2 等銨減硝條件下菜心NRTs基因表達(dá)53-55
• 3.5.3 等硝增銨條件下菜心氮素吸收55-56
• 3.5.4 等硝增銨條件下菜心NRTs基因表達(dá)56-59
• 4 討論59-67
• 4.1 菜心硝轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NRT1s的克隆59
• 4.2 菜心不同生長(zhǎng)時(shí)期硝態(tài)氮吸收能力及NRTs基因表達(dá)特性59-62
• 4.2.1 不同生長(zhǎng)時(shí)期根系氮素吸收59-60
• 4.2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期NRTs基因主要在根系起作用60-61
• 4.2.3 不同生長(zhǎng)時(shí)期菜心硝態(tài)氮吸收與NRTs基因表達(dá)的關(guān)系61-62
• 4.3 不同氮源處理對(duì)菜心氮素吸收及NRTs基因表達(dá)的影響62-64
• 4.3.1 菜心對(duì)不同形態(tài)與濃度氮素的吸收62-63
• 4.3.2 不同氮素形態(tài)與濃度對(duì)菜心NRTs基因表達(dá)的影響63-64
• 4.4 銨硝混合條件下菜心的氮素吸收64-66
• 4.5 等銨減硝及等硝增銨對(duì)菜心氮素吸收的影響66-67
• 5 結(jié)論67-68
• 致謝68-69
• 參考文獻(xiàn)69-77

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：1051260