本文關(guān)鍵詞：miRNA-625結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)靶基因AKT2調(diào)控的影響

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【摘要】：目的本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建AKT2基因3’端非翻譯區(qū)(3’untranslated regions,3’-UTR)熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,在培養(yǎng)的體外細(xì)胞中驗(yàn)證miRNA-625與AKT2基因的靶向調(diào)控關(guān)系,同時(shí)構(gòu)建miRNA-625靶序列中的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)rs2304186突變型熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒,驗(yàn)證SNP rs2304186在miRNA-625靶序列調(diào)控中的作用。方法通過生物信息學(xué)軟件TargetSan預(yù)測(cè)AKT2是miRNA-625的靶基因。PCR擴(kuò)增AKT2基因3’-UTR,構(gòu)建AKT2 3’-UTR rs2304186野生型熒光素酶報(bào)告基因載體(pMIR-AKT2-WT)、miRNA-625靶位點(diǎn)全突變型質(zhì)粒(pMIR-AKT2-MUT1)及rs2304186突變型質(zhì)粒(pMIR-AKT2-MUT2),通過Lipofectamine 2000將重組質(zhì)粒與miRNA-625 mimics或miRNA NC共轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞株、HEK-293T細(xì)胞株及A549細(xì)胞株,每個(gè)轉(zhuǎn)染組同時(shí)加入pRL-SV40作為矯正,雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)螢火蟲(Firefly)熒光素酶和海腎(Renilla)熒光素酶活性。結(jié)果構(gòu)建的重組熒光素酶報(bào)告載體經(jīng)PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定正確。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果顯示在三種細(xì)胞株中pMIR-AKT2-WT+miRNA-625mimics組相對(duì)熒光素酶活性比pMIR-AKT2-MUT2+miRNA-625 mimics均明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),pMIR-AKT2-MUT2+miRNA-625 mimics比pMIR-AKT2-MUT1+miRNA-625 mimics組明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論miRNA-625對(duì)野生型AKT2 3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因載體熒光素酶活性有明顯的抑制作用,證實(shí)miR-625能夠靶向調(diào)控AKT2基因。同時(shí)位于miRNA-625靶序列中的SNP rs2304186 TT型能夠降低miRNA-625與靶序列的結(jié)合效率。
【關(guān)鍵詞】：miRNA-625 AKT2基因 熒光素酶報(bào)告基因 3’端非翻譯區(qū) 單核苷酸多態(tài)性
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R562.25
【目錄】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-8
• 英文縮略詞8-11
• 第一章 緒論11-16
• 1、支氣管哮喘介紹11
• 2、miRNA介紹11-12
• 3、SNP的介紹12-13
• 4、AKT蛋白13-14
• 5、結(jié)論14-15
• 6、實(shí)驗(yàn)流程15-16
• 第二章 材料與方法16-29
• 2.1 材料：16-19
• 2.1.1 主要試劑16-17
• 2.1.2 主要設(shè)備 ：17-18
• 2.1.3 主要配置的試劑18-19
• 2.2 方法19-29
• 2.2.1 人體DNA抽提 參照TAKARA全血DNA抽提試劑盒說明書19-20
• 2.2.2 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后純化回收20-21
• 2.2.3 將純化回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)SacⅠ和HindⅢ 雙酶切酶切反應(yīng)21
• 2.2.4 pMIR-Report質(zhì)粒與pRL-SV40轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增及凍存21
• 2.2.5 質(zhì)粒抽提21-22
• 2.2.6 將提取的pMIR-Report質(zhì)粒進(jìn)行SacⅠ和HindⅢ 雙酶切22-23
• 2.2.7 pMIR-AKT2重組載體構(gòu)建23
• 2.2.8 將克隆成功的pMIR-AKT2重組載體PCR、雙酶切及測(cè)序鑒定23-24
• 2.2.9 定點(diǎn)突變24-26
• 2.2.10 細(xì)胞復(fù)蘇、換液、傳代及凍存26-27
• 2.2.11 16HBE、HEK-293T細(xì)胞株及A549細(xì)胞株轉(zhuǎn)染27-28
• 2.2.12 雙熒光素酶活性檢測(cè)28
• 2.2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析28-29
• 第三章 結(jié)果29-37
• 3.1 miRNA-625與AKT2基因互補(bǔ)配對(duì)序列的預(yù)測(cè)29
• 3.2 AKT23’-UTR野生型與突變型質(zhì)粒鑒定29-34
• 3.3 轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性檢測(cè)34-37
• 第四章 討論37-40
• 第五章 結(jié)論與展望40-41
• 第六章 參考文獻(xiàn)41-46
• 第七章 綜述46-68
• 1.miRNA概述47-49
• 2.miRNA在支氣管哮喘中的研究49-58
• 3.結(jié)論58
• 4.參考文獻(xiàn)58-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文68-69
• 致謝69

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