本文關(guān)鍵詞：低氧環(huán)境下蟾毒靈聯(lián)合順鉑抗人食管癌ECA109細(xì)胞研究

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【摘要】：背景低氧是實(shí)體腫瘤中普遍存在的現(xiàn)象,特別是實(shí)體腫瘤內(nèi)部血供不良的區(qū)域更為明顯,多種實(shí)體腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn),低氧微環(huán)境與腫瘤的耐藥密切相關(guān),那么如何逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥,進(jìn)一步誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為抗腫瘤治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。蟾毒靈(Bufalin)是一種在蟾酥中提取的具有抗腫瘤作用的中藥活性成分,屬于強(qiáng)心甾體類化合物,以往研究表明其抗腫瘤作用涉及促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)分化、抑制腫瘤血管新生、抑制腫瘤干細(xì)胞生長(zhǎng)、增強(qiáng)化療藥物療效等多個(gè)方面。低氧環(huán)境下,蟾毒靈能否誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡,對(duì)食管癌化療增感的作用目前尚不明確。目的探討化學(xué)物氯化鈷(CoCl_2)模擬的低氧環(huán)境下,蟾毒靈對(duì)食管鱗癌ECA109細(xì)胞的抑制增殖及對(duì)凋亡作用,明確其是否對(duì)順鉑(DDP、cisplatin)化療有增敏作用,并探討其可能的作用機(jī)制。方法1.食管鱗癌ECA109細(xì)胞分為:空白對(duì)照組(A)、蟾毒靈單藥組(B)、DDP組(C)、蟾毒靈+DDP組(D),其中B組設(shè)有5個(gè)濃度組(B-a 10nmol/L、B-b25nmol/L、B-c 50nmol/L、B-d 100nmol/L、B-e 200nmol/L),C組設(shè)有5個(gè)濃度組(C-a 2.5mg/L、C-b 5.0 mg/L、C-c 7.5mg/L、C-d 10mg/L、C-e 20mg/L),D組蟾毒靈濃度均為10nmol/L與C組5個(gè)濃度聯(lián)合(聯(lián)合a組、聯(lián)合b組、聯(lián)合c組、聯(lián)合d組、聯(lián)合e組)。2.CCK-8(Cell Counting Kit-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖:分別測(cè)定氯化鈷誘導(dǎo)的低氧環(huán)境下,蟾毒靈單藥組及DDP單藥組不同時(shí)間段(24h、48h)的細(xì)胞增殖抑制率,選用10nmol/L的蟾毒靈濃度與DDP組聯(lián)合,檢測(cè)不同時(shí)段(24h、48h)的細(xì)胞增殖抑制率。3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)低氧環(huán)境下,各實(shí)驗(yàn)組作用48h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。4.Hoechest 33342染色法檢測(cè)低氧環(huán)境下,各實(shí)驗(yàn)組作用48h后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。5.Western Blot法檢測(cè)低氧環(huán)境下,各實(shí)驗(yàn)組作用48h后對(duì)細(xì)胞內(nèi)的HIF-1α、NF-KBp65及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)情況。(其中4、5、6步實(shí)驗(yàn)的分組為:A組、C-b組、C-c組、聯(lián)合b組、聯(lián)合c組,分別另命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組)結(jié)果1.CCK-8結(jié)果顯示:低氧環(huán)境下,不同濃度的蟾毒靈對(duì)ECA109的增殖抑制率均顯著高于空白對(duì)照組(P0.05),且呈濃度依賴性(P0.05);在蟾毒靈各濃度組內(nèi),作用48h后的細(xì)胞增殖抑制率均高于作用24h后(P0.05)。不同濃度的順鉑對(duì)ECAl09的增殖抑制率均高于空白對(duì)照組(P0.05),呈濃度依賴性(P0.05),聯(lián)合蟾毒靈10nmol/L組的增殖抑制率均高于同濃度單藥順鉑組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且隨著濃度的增加,其對(duì)ECAl09細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用不斷增強(qiáng)。2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)低氧環(huán)境下,藥物作用細(xì)胞48h后的凋亡率,結(jié)果顯示當(dāng)順鉑藥物濃度為5.0mg/L時(shí)細(xì)胞凋亡率為(32.84±4.42)%,順鉑藥物濃度7.5mg/L時(shí)細(xì)胞凋亡率為(43.17±4.03)%,當(dāng)順鉑5.0mg/L與蟾毒靈10 nmol/L聯(lián)合時(shí)細(xì)胞凋亡率為(46.72±3.32)%,當(dāng)順鉑7.5mg/L與蟾毒靈10 nmol/L聯(lián)合時(shí)細(xì)胞凋亡率為(61.22±2.12)%,不同濃度的順鉑均能引起ECAl09的凋亡,呈濃度依賴性(P0.05),當(dāng)與蟾毒靈聯(lián)合后,則能明顯提高其凋亡率(P0.05)。3.Hoechest 33342染色熒光顯微鏡下檢測(cè)低氧環(huán)境下,藥物作用48h后細(xì)胞凋亡形態(tài)顯示:低氧環(huán)境下,對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)大小均勻,DDP干預(yù)48h后,細(xì)胞核濃縮、凋亡小體出現(xiàn),不同濃度的順鉑對(duì)ECAl09的凋亡率均高于空白對(duì)照組(P0.05),呈濃度依賴性(P0.05),聯(lián)合蟾毒靈10nmol.L-1組的凋亡率均高于同濃度單用順鉑組(P0.05)。4.Western Blot結(jié)果顯示:低氧環(huán)境下,不同實(shí)驗(yàn)藥物組作用細(xì)胞48h后與空白對(duì)照組比較,HIF-1α、NF-KBp65及Bcl-2的蛋白表達(dá)量均降低(P0.05);與蟾毒靈聯(lián)合后較順鉑單藥組HIF-1α、NF-KBp65及Bcl-2的蛋白表達(dá)量均降低(P0.05);不同實(shí)驗(yàn)組作用細(xì)胞48h后與空白對(duì)照組比較,Bax的蛋白表達(dá)量均升高(P0.05);與蟾毒靈聯(lián)合后較順鉑單藥組Bax的蛋白表達(dá)量均升高(P0.05)。結(jié)論低氧環(huán)境下,蟾毒靈對(duì)食管鱗癌ECA109細(xì)胞的增殖具有抑制作用,且呈時(shí)間濃度依賴性;蟾毒靈可以增加ECA109細(xì)胞對(duì)順鉑化療的敏感性。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-KBp65/HIF-1α通路的高表達(dá),進(jìn)一步導(dǎo)致其下游靶基因Bcl-2的蛋白表達(dá)水平降低,Bax蛋白表達(dá)水平增高,來(lái)增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用。
【關(guān)鍵詞】：低氧 順鉑(DDP、cisplatin) 化療增敏 人食管鱗癌細(xì)胞 蟾毒靈(Bufalin)
【學(xué)位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-12
• 1 實(shí)驗(yàn)材料12-17
• 2 實(shí)驗(yàn)方法17-23
• 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析23
• 4 結(jié)果23-27
• 5 討論27-29
• 6 小結(jié)29-30
• 附圖30-33
• 參考文獻(xiàn)33-37
• 綜述：蟾毒靈抗腫瘤的研究進(jìn)展37-42
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 附錄42-43
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況43-44
• 致謝44-45
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷45

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本文編號(hào)：998591