本文關鍵詞：黃芩總黃酮對肺癌EMT的影響及Meta分析Vimentin對NSCLC預后的作用

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【摘要】：肺癌(1ung cancer)是原發(fā)性肺癌的簡稱,其中85%是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。2008年,全球確診為肺癌約1.61億人,為癌癥總人數(shù)的13%。我國每年肺癌發(fā)生增長率為26.9%,若不及時采取相關措施,2025年可能達100萬人,其中云南宣威市肺癌標準化死亡千分率為0.83,是全國平均水平的4.11倍。上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)指具有細胞極性、細胞間黏附的上皮細胞失去原有特性,轉變成遷移和侵襲力較大的間質細胞的過程。EMT與腫瘤轉移、耐藥及復發(fā)之間的關系密切。參與腫瘤EMT的細胞外信號分子有Notch, Hedgehog, TGF-P(Transforming growth factor-β)、RTK (receptor tyrosine kinase)、Wnt等。目前,EMT已成為腫瘤防治研究的熱點。大量研究已表明,EMT廣泛存在于肺癌之中,并在轉移、耐藥及肺癌干細胞中起著重要作用。目前,基于天然化合物具有結構豐富、靶點多等特點,已發(fā)現(xiàn)諸多天然活性成分及化合物如：中藥黃芩和川貝母提取液、南蛇藤乙酸乙酯提取物、蛇床子素、白藜蘆醇、毛地黃黃酮等對腫瘤EMT有抑制作用。黃芩以根部入藥,是唇形科多年生草本植物。肺癌在中醫(yī)中屬于肺積、咳嗽、咯血、胸痛等范疇,中醫(yī)治療肺癌的處方中均利用黃芩的瀉肺清熱之功效。黃芩對肺癌的藥理作用機制包括：誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖、化療增敏作用、阻止癌細胞轉移等。肺癌患者治療失敗主要原因是腫瘤耐藥、轉移及復發(fā),且均有EMT參與。至今為止,關于黃芩對肺癌EMT是否有影響的研究尚未見報道。本課題擬研究黃芩總黃酮提取物對TGF-β1誘導肺癌A549細胞發(fā)生EMT的影響。首先,通過TGF-β1誘導A549細胞發(fā)生EMT,然后黃芩總黃酮提取物對其進行干預；采用MTT法、劃痕實驗、Transwell小室和PT-PCR實驗對其進行研究；同時,研究黃芩總黃酮提取物對肺癌A549細胞因EMT而可能產生順鉑耐藥、遷移和侵襲的影響。本研究結果：黃芩總黃酮提取物作用于TGF-p1誘導組和未誘導組中的肺癌A549細胞72h后的IC50值分別是48.790ug/ml和43.178ug/ml(P=0.0393),在黃芩總黃酮提取物濃度為50ug/mL時,兩組細胞增殖抑制率存在顯著差異,但在其他濃度均無顯著差異(P0.05)；順鉑對TGF-p1未誘導組、誘導組及誘導組聯(lián)合50ug/ml黃芩總黃酮提取物的肺癌A549細胞作用48h的IC50值分別是2.993ug/ml、3.314ug/ml 和 2.434ug/ml (P=0.0025),聯(lián)合誘導組相對于未誘導組和誘導組的順鉑IC50值具有顯著性差異(P0.05),且分別降低18.68%和26.55%;雖然誘導組和未誘導組之間的IC50并未存在顯著差異(P0.05),但不管肺癌A549細胞是否發(fā)生EMT,黃芩總黃酮提取物在順鉑濃度2～4ug/ml內都增加其對順鉑的敏感性,奇怪的是在0～1ug/ml 和 6～8ug/ml內起著相反的作用。不論TGF-β1誘導組還是未誘導組的肺癌A549細胞,黃芩總黃酮提取物對其均有抑制細胞遷移、侵襲的作用,呈濃度依賴性,且兩組的細胞遷移和侵襲抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。黃芩總黃酮提取物可逆轉TGF-β1誘導下調上皮細胞標記蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和上調間質細胞標記蛋白波形蛋白(Vimentin) mRNA表達,呈濃度依賴性。綜上所述,黃芩總黃酮提取物對TGF-β1誘導肺癌549細胞發(fā)生EMT有一定的抑制作用,這可能與上調E-cadherin和下調Vimentin mRNA表達有關。此外,不管肺癌549細胞是否發(fā)生EMT,黃芩總黃酮提取物均抑制其細胞遷移、侵襲,并呈濃度依賴性,且在順鉑濃度2～4ug/ml內增加其對順鉑敏感性。病理TNM(tumor node metastasis)分類、年齡、性別及腫瘤類型均是影響非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者預后的重要因素,上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)參與腫瘤形成、侵襲、轉移、復發(fā)及耐藥過程,其關鍵生物調控因子可為臨床預后提供重要的生物標記分子。EMT過程中上皮細胞標記蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)低表達不利于NSCLC患者總生存期(overall survival, OS),且與腫瘤分化、淋巴轉移、血管侵襲及TNM分期有關。波形蛋白(Vimentin)是間質細胞標記蛋白,近年隨著關于Vimentin表達對NSCLC患者預后影響的研究逐漸增多,其研究結果仍存在一定差異。至今為止,國內外尚無關于Vimentin表達對NSCLC患者預后的影響進行Meta分析。因此,本研究采用Cochrane系統(tǒng)評價方法,Meta分析免疫組化檢測NSCLC患者腫瘤組織Vimentin表達水平對NSCLC患者OS和無病生存期(disease-free survival, DFS)的影響,以期為其臨床應用提供相關證據(jù)。從CNKI、Wang Fang、 VIP、CMB、EMBASE、MEDLINE、PUBMED、The Cochrane library、The clinical trail、Elsevier SD外文期刊數(shù)據(jù)庫、SCI科學引文索引數(shù)據(jù)庫中查找Vimentin表達與NSCLC患者預后相關的前瞻性隊列研究,文獻檢索時限均從建庫至2015年2月2日。由兩位研究者對檢索踢重后得到的研究根據(jù)納入和排除標準,獨立篩選文獻、提取材料和評估質量,并交叉核查后,采用Stata12.0軟件對結果進行Meta分析。本研究共納入9篇文獻,有9項研究(n=1 302)。Meta分析Vimentin表達對N SCLC患者OS和DFS影響的合并風險比(hazard ratio, HR)分別為HR=2.04,95%CI(1.57,2.66), P0.001 和 HR=1.56,95%CI(1.20-2.04), P=0.001;采用Begg、Egger檢驗分析OS時納入9個研究的結果表明：無統(tǒng)計學發(fā)表偏倚；且敏感性分析結果表明：本次分析結果較穩(wěn)定�？傊�,Vimentin高表達是NSCLC患者OS和DFS的不利風險因素,但由于本次meeta分析納入的研究數(shù)量較少,其結論有待大樣本量的研究進行證實。
【關鍵詞】：黃芩總黃酮提取物 非小細胞肺癌 上皮間質轉化 順鉑 波形蛋白 非小細胞肺癌 無病生存期 總生存期 Meta分析
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-22
• 縮略詞22-23
• 黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導肺癌A549細胞上皮間質轉化的影響23-91
• 第一章 緒論24-38
• 1.1 非小細胞肺癌與上皮間質轉化24-30
• 1.1.1 肺癌流行病學24
• 1.1.2 上皮間質轉化定義及分類24-25
• 1.1.3 上皮間質轉化分子調控機制25-26
• 1.1.4 肺癌中上皮間質轉化現(xiàn)象26-27
• 1.1.5 上皮間質轉化與肺癌轉移27-28
• 1.1.6 上皮間質轉化與肺癌耐藥28-29
• 1.1.6.1 上皮間質轉化與化療藥物耐藥28
• 1.1.6.2 上皮間質轉化與分子靶向藥物耐藥28-29
• 1.1.7 上皮間質轉化與肺癌干細胞29-30
• 1.2 上皮間質轉化中潛在抗腫瘤作用靶點30-32
• 1.3 天然化合物與腫瘤上皮間質轉化32-34
• 1.4 黃芩與肺癌34-35
• 1.5 本課題研究的內容、目的意義及技術路線35-38
• 1.5.1 研究內容35-36
• 1.5.2 研究的目的意義36-37
• 1.5.3 技術路線37-38
• 第二章 材料與方法38-60
• 2.1 材料38-41
• 2.1.1 供試樣品38
• 2.1.2 化學藥品和試劑38-39
• 2.1.3 主要儀器與耗材39-40
• 2.1.4 主要試劑配制40-41
• 2.2 黃芩總黃酮提取物樣品制備41-44
• 2.2.1 黃芩總黃酮提取物提取方案41-42
• 2.2.2 黃芩總黃酮提取物提取技術路線圖42
• 2.2.3 黃芩總黃酮提取物鑒定42-43
• 2.2.3.1 金屬鹽類試劑的絡合反應42-43
• 2.2.3.2 堿性試劑顯色反應43
• 2.2.4 黃芩總黃酮提取物工作液配制43-44
• 2.2.4.1 配藥過程43-44
• 2.3 黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導A549發(fā)生EMT的影響44-58
• 2.3.1 A549細胞培養(yǎng)44-45
• 2.3.1.1 細胞株的凍存44
• 2.3.1.2 凍存細胞株的復蘇44-45
• 2.3.1.3 細胞株的傳代45
• 2.3.2 摸索TGF-β_1誘導A549細胞發(fā)生EMT的時間45-46
• 2.3.3 MTT法46-48
• 2.3.3.1 MTT實驗原理46
• 2.3.3.2 MTT法檢測不同濃度黃芩總黃酮提取物對肺癌A549細胞作用72h的細胞增殖抑制率46
• 2.3.3.3 MTT法檢測不同濃度黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導肺癌A549細胞作用48h的細胞增殖抑制率46-47
• 2.3.3.4 MTT法檢測不同濃度順鉑對肺癌A549細胞作用48h的細胞增殖抑制率47
• 2.3.3.5 MTT法檢測不同濃度順鉑對TGF-β_1誘導肺癌A549細胞作用48h的細胞增殖抑制率47-48
• 2.3.3.6 MTT法檢測50ug/ml黃芩總黃酮提取物聯(lián)合不同濃度順鉑對TGF-β_1誘導肺癌A549細胞作用48h的細胞增殖抑制率48
• 2.3.4 劃痕實驗48-49
• 2.3.4.1 實驗原理48
• 2.3.4.2 細胞劃痕實驗研究不同濃度黃芩總黃酮提取物對肺癌A549細胞作用48h的細胞遷移抑制率48-49
• 2.3.4.3 細胞劃痕實驗研究不同濃度黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導肺癌A549細胞作用48h的細胞遷移抑制率49
• 2.3.5 Transwell小室實驗49-52
• 2.3.5.1 Transwell小室侵襲實驗原理49-50
• 2.3.5.2 預實驗方案及優(yōu)化條件50-51
• 2.3.5.3 黃芩總黃酮提取物對肺癌A549細胞作用48h不同濃度的細胞侵襲抑制率51
• 2.3.5.4 黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導A549細胞發(fā)生EMT作用48h不同濃度的細胞侵襲抑制率51-52
• 2.3.6 RT-PCR52-58
• 2.3.6.1 實驗原理52
• 2.3.6.2 采用Primer Premier 5.0結合oligo6.0軟件設計引物52-53
• 2.3.6.3 細胞不同處理53-54
• 2.3.6.4 細胞總RNA提取54
• 2.3.6.5 細胞總RNA質量評價54
• 2.3.6.6 配制1.3%RNA電泳瓊脂糖凝膠54-55
• 2.3.6.7 RNA電泳55
• 2.3.6.8 1st strandcDNA合成反應55-56
• 2.3.6.9 目標片段PCR擴增Tm摸索56-57
• 2.3.6.10 目標片段PCR擴增57-58
• 2.3.6.11 配制1.3% DNA電泳瓊脂糖凝膠58
• 2.3.6.12 DNA電泳58
• 2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析58-60
• 2.4.1 IC_(50)值58-59
• 2.4.1.1 IC_(50)計算方法58-59
• 2.4.2 細胞增殖抑制率59
• 2.4.3 細胞遷移抑制率59
• 2.4.4 細胞侵襲抑制率59-60
• 第三章 結果60-75
• 3.1 黃芩總黃酮提取物提取及鑒別結果60
• 3.2 TGF-β_1誘導A549細胞發(fā)生EMT的時間結果60-61
• 3.3 MTT實驗結果61-66
• 3.3.1 不同濃度黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導組、未誘導組A549細胞作用72h的細胞增殖抑制率結果61-63
• 3.3.2 不同濃度順鉑對TGF-β_1未誘導組、TGF-β_1誘導組以及TGF-β_1誘導組聯(lián)合50ug/ml黃芩總黃酮提取物肺癌A549細胞作用48h的細胞增殖抑制率結果63-66
• 3.4 細胞劃痕實驗結果66-68
• 3.4.1 不同濃度黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導組、未誘導組A549細胞作用48h的細胞遷移抑制率結果66-68
• 3.5 Transwell小室實驗結果68-70
• 3.5.1 不同濃度黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導組、未誘導組A549細胞作用48h的細胞侵襲抑制率結果68-70
• 3.6 RT-PCR實驗結果70-75
• 3.6.1 總RNA電泳檢測結果70
• 3.6.2 總RNA濃度檢測結果70-71
• 3.6.3 不同濃度黃芩總黃酮提取物對TGF-β_1誘導組、未誘導組A549細胞作用48h的上皮細胞標記蛋白E-cadherin、間質細胞標記蛋白Vimentin的mRNA表達結果71-75
• 第四章 討論與總結75-77
• 4.1 討論75-76
• 4.2 總結76-77
• 參考文獻77-91
• Meta分析Vimentin表達對NSCLC患者預后的影響91-114
• 第一章 緒論92-93
• 1.1 Meta分析背景與目的92-93
• 第二章 材料與方法93-101
• 2.1 文獻檢索93-98
• 2.1.1 CNKI檢索策略93
• 2.1.2 Wang Fang檢索策略93
• 2.1.3 VIP檢索策略93-94
• 2.1.4 CMB檢索策略94
• 2.1.5 EMBASE和MEDLINE檢索策略94-95
• 2.1.6 PUBMED檢索策略95-97
• 2.1.7 Elsevier SD外文期刊數(shù)據(jù)庫檢索策略97
• 2.1.8 SCI科學引文索引數(shù)據(jù)庫檢索策略97
• 2.1.9 The Cochrane library檢索策略97
• 2.1.10 The clinical trail檢索策略97-98
• 2.2 文獻納入排除標準98
• 2.2.1 納入標準98
• 2.2.2 排除標準98
• 2.3 資料提取與文獻質量評價98-100
• 2.4 統(tǒng)計學方法100-101
• 第三章 結果101-109
• 3.1 文獻納入101
• 3.2 納入文獻基本特征101-103
• 3.3 文獻質量評價103
• 3.4 Vimentin表達對NSCLC患者預后影響的meta分析結果103-106
• 3.4.1 對NSCLC患者OS的影響103-105
• 3.4.2 對NSCLC患者DFS的影響105-106
• 3.5 發(fā)表偏倚106-108
• 3.6 敏感性分析108-109
• 第四章 討論與總結109-111
• 參考文獻111-114
• 致謝114-115
• 附錄A 攻讀碩士期間發(fā)表論文目錄115-116
• 附錄B 其他需要說明的內容116

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 張春云;謝偉剛;張雅麗;吳冬青;任雪峰;楊自嶸;;黃芩總黃酮的含量測定及提取工藝優(yōu)化[J];光譜實驗室;2011年03期

2 宋英華;張才擎;曹智新;徐嘉雯;王令成;林曉燕;;肺鱗癌腫瘤浸潤前沿細胞的EMT表型特點及臨床意義[J];中國肺癌雜志;2014年04期

3 王英妹;鄭海峰;武鐵軍;李慶祥;張健;;黃芩苷干預肺腺癌細胞前后腫瘤細胞侵襲能力的變化[J];河北醫(yī)藥;2012年09期

4 曲丹;李鈺;徐小Z，

本文編號：997925