本文關(guān)鍵詞：桔梗皂苷-D對NSCLC細(xì)胞H460和A549的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的：非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%-85%,其惡性程度較高,5年生存率不到15%。并且,約80-90%的NSCLC患者最終死于肺癌的轉(zhuǎn)移。因此,更有效的抗NSCLC藥物亟需被開發(fā),從而提高患者生存率。近年來,60%的抗癌新藥直接或間接來自于天然藥物,尤其是中藥中提取的單體在癌癥的治療和預(yù)防中起到重要作用。中藥桔梗被廣泛地用于中醫(yī)臨床治療各種肺部和呼吸系統(tǒng)疾病。桔梗皂苷-D(Platycodin-D, PD)是從中藥桔梗中提取的一種三萜類單體,是桔�？拱┳饔玫闹饕行С煞帧Ｇ捌趯嶒炌ㄟ^高通量篩選發(fā)現(xiàn)PD對NSCLC中的H460和A549細(xì)胞株均具有有效的體外抑制作用。本論文旨在從阻滯細(xì)胞生長周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬和抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移四個方面探究PD對NSCLC細(xì)胞H460和A549的作用機(jī)制,為PD的進(jìn)一步藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。方法：采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖抑制率；Hoechst-33258熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化；透射電鏡(TEM)觀察細(xì)胞超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞周期分布和早期凋；Annexin-V/PI/Hoechst-33258染色結(jié)合高內(nèi)涵(HCS)分析細(xì)胞凋亡；實時定量PCR (RT-PCR)檢測細(xì)胞中LC3-Ⅱ、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平；細(xì)胞粘附實驗、劃痕實驗、Transwell小室侵襲實驗分別檢測細(xì)胞粘附、遷移和侵襲能力；Western-blot蛋白印跡法分析細(xì)胞周期、線粒體凋亡通路、MAPK信號通路、PI3K/Akt/mTOR信號通路相關(guān)蛋白及MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果：1.MTT檢測結(jié)果顯示,PD有效抑制H460和A549細(xì)胞存活率和增殖,并均呈劑量和時間依賴性。FCM檢測結(jié)果表明,與空白對照組相比,PD作用H460細(xì)胞后,G2／M和S期細(xì)胞分布數(shù)量顯著增加(P0.05)；PD作用A549細(xì)胞后,GO／G1期細(xì)胞分布數(shù)量顯著增加(P0.05)。 Western-blot進(jìn)一步檢測PD作用后細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),H460細(xì)胞中G2／M和S期相關(guān)蛋白Cyclin-E2、CDK2、Cyclin-B1和p-Cdc2的表達(dá)下調(diào),并且細(xì)胞周期抑制蛋白P27的表達(dá)上調(diào)；而在A549細(xì)胞中GO／G1期相關(guān)蛋白Cyclin-D1, Cyclin-D3, CDK4和CDK6的表達(dá)下調(diào),并且細(xì)胞周期抑制蛋白P18的表達(dá)上調(diào)。同時,PD抑制細(xì)胞周期下游調(diào)控蛋白E2F1和p-Rb(Ser807和Ser795)表達(dá)。2. Hoechst-33258熒光染色發(fā)現(xiàn),PD作用后的H460和A549細(xì)胞都出現(xiàn)細(xì)胞核凋亡形態(tài)的改變：細(xì)胞核縮小,核染色質(zhì)碎裂,形成多個微核,并且,隨著PD濃度的增加,細(xì)胞核凋亡形態(tài)越明顯。FCM檢測發(fā)現(xiàn),PD增加了兩種細(xì)胞凋亡率,并呈濃度依賴性(P0.05或P0.01)。高內(nèi)涵分析發(fā)現(xiàn),隨著PD濃度的增加,H460和A549細(xì)胞中Annexin.V ／PI/Hoechest.33258的平均熒光密度增加(P0.05),表明PD誘導(dǎo)兩種凋亡并呈濃度依賴性。Western-blot進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn),PD通過上調(diào)Bax.Bim.Caspase-9.cleaved-Caspase-3和PARP的表達(dá),下調(diào)Bcl-2和Caspase-3的表達(dá)誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞線粒體途徑凋亡；同時,PD抑制Erk信號通路中Ras.p-c-Raf和p-Erk蛋白的表達(dá),并且PD誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞凋亡可能與此作用有關(guān)。3.TCM觀察發(fā)現(xiàn),PD作用H460和A549細(xì)胞后,細(xì)胞中出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體。Western-blot檢測發(fā)現(xiàn),PD通過增加細(xì)胞內(nèi)LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化水平和Atg-3.Atg-7. Beclin-1表達(dá)水平誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞自噬。RT-PCR檢測自噬金指標(biāo)LC3-II在mRNA水平變化,發(fā)現(xiàn)PD上調(diào)了兩種細(xì)胞中LC3-Ⅱ mRNA的表達(dá)(P0.05)。進(jìn)一步檢測PD對P13K/Akt/mTOR信號通路作用,發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞中p-Akt(Ser473).p-p70S6K(Thr37/46)和p-4EBP1(Thr37/46)的表達(dá)被抑制。并且,通過使用胰島素(P13K/Akt/mTOR信號通路激活劑)、LY294002(P13K抑制劑)和雷帕霉素(mTOR抑制劑)進(jìn)一步證明,PD誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞自噬與抑制P13K/Akt/mTOR信號通路有關(guān)。同時,檢測PD對MAPK信號通路的作用,發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞內(nèi)p-p38 MAPK和p-JNK的表達(dá)水平增高,然而,p-Erkl/2的表達(dá)被抑制。并通過使用U0126(Erk1/2抑制劑)、SP60012(JNK抑制劑)和SB203580(p38 MAPK抑制劑)進(jìn)一步證明了PD誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞自噬和激活p-p38MAPK和JNK表達(dá)有關(guān),而與抑制Erkl/2無關(guān)。4.PD有效抑制H460和A549細(xì)胞粘附、侵襲和遷移能力,并呈濃度依賴性(P0.05)。PD降低H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9 mRNA的表達(dá)(P0.01)；同時,PD下調(diào)H460和A549細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá),并抑制其上游Ras、p-c-Raf、p-Erk1/2和p-Akt的表達(dá),并呈濃度和時間依賴性。結(jié)論：1.PD有效抑制H460和A549細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性。并且,PD引發(fā)H460細(xì)胞S和G2/M期周期阻滯和A549細(xì)胞G0/G1期周期阻滯。2.PD通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞凋亡誘導(dǎo),并且此凋亡誘導(dǎo)作用可能與抑制Erk信號通路有關(guān)。3.PD通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路和激活JNK和p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞自噬。4.PD抑制H460和A549細(xì)胞粘附、侵襲和遷移,并且此作用與下調(diào)MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表達(dá)、抑制其上游Erk信號通路和p-Akt表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：桔梗皂苷-D 細(xì)胞周期 凋亡 自噬 轉(zhuǎn)移 PI3K/Akt/mTOR信號通路 MAPK信號通路
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 理論研究16-21
• 第一章 桔梗皂苷-D抗NSCLC的理論基礎(chǔ)16-18
• 1. 中醫(yī)對肺癌的認(rèn)識16
• 2. 中藥桔梗與肺癌治療16-17
• 3. 桔梗皂苷-D與肺癌治療17-18
• 第二章 抗腫瘤藥物主要作用機(jī)理18-21
• 1. 阻滯腫瘤細(xì)胞周期18
• 2. 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞程序性死亡18-20
• 3. 抑制腫瘤轉(zhuǎn)移20-21
• 第二部分 實驗研究21-57
• 第一章 PD對NSCLC細(xì)胞H460和A549體外增殖抑制和細(xì)胞周期阻滯作用初探21-29
• 1. 材料和方法21-22
• 2. 實驗方法22-23
• 3. 結(jié)果23-27
• 4. 討論27-29
• 第二章 PD誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究29-39
• 1. 材料和方法29
• 2. 實驗方法29-30
• 3. 結(jié)果30-37
• 4. 討論37-39
• 第三章 PD誘導(dǎo)H460和A549細(xì)胞自噬及其機(jī)制研究39-49
• 1. 材料和方法39
• 2. 實驗方法39-40
• 3. 結(jié)果40-47
• 4. 討論47-49
• 第四章 PD抑制H460和A549細(xì)胞粘附、侵襲和遷移的作用機(jī)制研究49-57
• 1. 材料和方法49
• 2. 實驗方法49-50
• 3. 結(jié)果50-56
• 4. 討論56-57
• 結(jié)論57-58
• 參考文獻(xiàn)58-64
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的研究成果64-65
• 致謝65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：993847