發(fā)布時(shí)間：2017-10-08 11:13

  本文關(guān)鍵詞：P2X7受體在結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌進(jìn)展過(guò)程中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： P2X7受體 炎癥性腸病 結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌 HT29 STAT3

【摘要】：【研究目的】P2X7受體是以ATP配體的離子通道,由3個(gè)同源亞基組成,每個(gè)亞基有兩個(gè)穿膜結(jié)構(gòu)域、一個(gè)大的胞外環(huán)、一個(gè)短氮端和一個(gè)長(zhǎng)碳端[1]。P2X7受體在上皮細(xì)胞以及免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等顯著表達(dá)[1-3],ATP/P2X7受體可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生許多生物活動(dòng),如增強(qiáng)吞噬功能、誘發(fā)炎性小體形成、促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放等[4,5],與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)動(dòng)物模型,P2X7受體發(fā)揮明顯的促炎效應(yīng)[6,7]。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn),P2X7受體在眾多腫瘤組織表達(dá)顯著[8],而且腫瘤微環(huán)境ATP含量豐富,可以激活P2X7受體[9,10]。研究表明P2X7受體對(duì)眾多腫瘤的生長(zhǎng)有重要影響,甚至還在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌(colitis-associated cancer,CAC)與IBD關(guān)系密切,是典型的炎癥相關(guān)的腫瘤。CAC為腸道上皮源性的腫瘤,研究也證實(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)P2X7受體[8]。P2X7受體可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)間接影響腫瘤進(jìn)展,也可直接影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本文旨在研究P2X7受體在CAC進(jìn)展過(guò)程中的作用及機(jī)制。【研究方法】1.結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌模型的建立在給予6-8周的雌性C57BL/6N小鼠腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)12.5 mg/kg后,分別在第2、5、8周給予2.5%的葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium,DSS)飲用水,其余時(shí)間給予正常飲用水,總共造模時(shí)程為10周。2.Western Blot10μl蛋白樣品上樣于SDS-PAGE膠。電泳(100 V,150 min)、轉(zhuǎn)膜(300 m A,90 min)。用5%的脫脂牛奶TBST溶液室溫下封閉1 hr。配制待檢測(cè)蛋白的抗體孵育,4°C輕搖過(guò)夜。TBST洗膜。根據(jù)一坑種屬選擇適當(dāng)HRP結(jié)合的二抗室溫孵育1hr。TBST洗膜。混合Luminol試劑的A液、B液,進(jìn)行顯色。3.細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)中HT29細(xì)胞購(gòu)自上海和元生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為McCoy’s 5A完全培養(yǎng)基,細(xì)胞培養(yǎng)在5%CO2,37°C的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。4.細(xì)胞免疫熒光配制溶液:2g蔗糖溶于50 ml 4%的多聚甲醛(PFA),固定細(xì)胞。PBS洗細(xì)胞。加入0.01 mol/L p H6.0的檸檬酸鹽緩沖液,在80℃的水浴鍋中煮20 min,取出,室溫下自然冷卻。PBS洗細(xì)胞。一抗孵育,4℃過(guò)夜。PBS洗細(xì)胞。二抗避光孵育1 hr。PBS洗細(xì)胞。加入Hoechst 33258染色液染細(xì)胞核,室溫10 min。PBS洗細(xì)胞。用甘油封片保存,熒光顯微鏡下觀察拍照。5.細(xì)胞活力檢測(cè)待測(cè)樣品加入CCK溶液,細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 hr。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。6.細(xì)胞增殖檢測(cè)待測(cè)樣品加入Brd U溶液,細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 hr。去除上清液,加入Fixing/Denaturing溶液,室溫下靜置30 min。去除上清液,加入Brd U抗體溶液,室溫下靜置1 hr。去除上清液,用Wash Buffer洗細(xì)胞。加入HRP結(jié)合的二抗,室溫下靜置30 min。去除上清液,用Wash Buffer洗細(xì)胞。加入TMB底物,室溫下靜置30 min。加入終止液,用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光值。7.細(xì)胞凋亡檢測(cè)消化細(xì)胞,用PBS洗滌,收集細(xì)胞。Binding Buffer懸浮細(xì)胞。加入FITC Annexin V混勻,室溫避光孵育15 min。加入PI混勻,室溫避光孵育4 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。8.細(xì)胞周期檢測(cè)消化收集細(xì)胞,棄上清,PBS洗滌細(xì)胞。加入75%乙醇,混勻,4℃過(guò)夜。離心收集細(xì)胞,棄上清,PBS洗滌細(xì)胞。加入PI/Rnase Staining Buffer混勻,室溫避光孵育40 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。【結(jié)果】1、P2X7受體特異性拮抗劑BBG減緩了CAC小鼠的體重恢復(fù),降低了CAC小鼠的生存率,促進(jìn)了CAC小鼠腸道腫瘤的形成及CAC模型小鼠腸道腫瘤組織STAT3的磷酸化。2、P2X7受體激動(dòng)劑Bz ATP抑制了CAC小鼠腸道腫瘤的形成和CAC模型小鼠腸道腫瘤組織STAT3的磷酸化。3、P2X7受體在HT29細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)。4、P2X7受體激動(dòng)劑BzATP引起HT29細(xì)胞空泡化。5、P2X7受體激動(dòng)劑Bz ATP引起HT29細(xì)胞G1期阻滯,抑制了HT29細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致HT29細(xì)胞活力降低,而對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。6、P2X7受體激動(dòng)劑BzATP抑制了HT29細(xì)胞STAT3的磷酸化�！窘Y(jié)論】1、P2X7受體在小鼠CAC進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮一定的抑制作用。2、人結(jié)腸癌細(xì)胞的P2X7受體可能通過(guò)抑制STAT3的磷酸化而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。3、P2X7受體激活可導(dǎo)致小鼠CAC腸道腫瘤組織STAT3磷酸化水平的降低,這可能是P2X7受體介導(dǎo)的抑制CAC進(jìn)展的重要機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：P2X7受體 炎癥性腸病 結(jié)腸炎相關(guān)性腸癌 HT29 STAT3
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R574.62;R735.35
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文縮略語(yǔ)表11-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-24
• 一、主要儀器與試劑14-18
• 二、實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-40
• 一、P2X7受體特異性拮抗劑BBG對(duì)CAC小鼠的影響24-27
• 二、P2X7受體激動(dòng)劑BzATP對(duì)CAC小鼠的影響27-28
• 三、P2X7受體相關(guān)分子對(duì)小鼠CAC腫瘤形成的影響28-30
• 四、P2X7受體在人結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中的作用及其分子機(jī)制30-40
• 討論40-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-57
• 綜述（1）57-77
• 參考文獻(xiàn)64-77
• 綜述（2）77-93
• 參考文獻(xiàn)86-93
• 學(xué)習(xí)期間發(fā)表的論文93-94
• 致謝94-95

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 Georgina L Hold;Megan Smith;Charlie Grange;Euan Robert Watt;Emad M El-Omar;Indrani Mukhopadhya;;Role of the gut microbiota in inflammatory bowel disease pathogenesis: What have we learnt in the past 10 years?[J];World Journal of Gastroenterology;2014年05期

，

本文編號(hào)：993694