發(fā)布時(shí)間：2017-10-08 08:30

  本文關(guān)鍵詞：負(fù)載結(jié)腸癌干細(xì)胞gp96-肽復(fù)合物DC-CIK對(duì)同源腫瘤干細(xì)胞殺傷作用的初步研究

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【摘要】：【目的】研究結(jié)腸癌干細(xì)胞來(lái)源的gp96-肽復(fù)合物沖擊樹(shù)突細(xì)胞(DC)后,與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)共培養(yǎng),探討其對(duì)結(jié)腸癌干細(xì)胞的殺傷效果。為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)�！緝�(nèi)容】論文首先采用3種方法檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞HT29中是否存在腫瘤干細(xì)胞(CSC),三種方法分別是:雙苯酰亞胺33342熒光染料檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)HT29細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞(SP)的比例,流式細(xì)胞儀分析HT29貼壁細(xì)胞中CD133+細(xì)胞的比例,應(yīng)用Western blotting檢測(cè)其ALDH1蛋白表達(dá)情況;確認(rèn)存在CSC后利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法富集HT29結(jié)腸癌干細(xì)胞,并于顯微鏡下觀察其成球狀況及形態(tài)學(xué)特征;利用流式儀(檢測(cè)HT29微球中CD133+細(xì)胞比例)、Western blotting(檢測(cè)ALDH1蛋白表達(dá)情況)及克隆形成試驗(yàn)對(duì)HT29結(jié)腸癌干細(xì)胞的富集效果進(jìn)行檢測(cè),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。繼而,從HT29微球中提取細(xì)胞總蛋白后,通過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析,經(jīng)Con A親和層析、DEAE離子交換層析純化gp96-肽復(fù)合物備用;從臍血中分離單個(gè)核細(xì)胞,分別培養(yǎng)DC和CIK,用純化的gp96-肽復(fù)合物沖擊DC,與CIK共培養(yǎng),采用LDH法檢測(cè)gp96-肽復(fù)合物沖擊DC-CIK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌CSC的殺傷活性,其結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析�！痉椒ā�1.用雙苯酰亞胺33342熒光染料檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)HT29細(xì)胞中側(cè)群細(xì)胞的比例,利用流式、Western blotting分別檢測(cè)HT29貼壁細(xì)胞CD133+細(xì)胞的比例及ALDH1蛋白表達(dá)情況。2.使用添加多種因子的無(wú)血清培養(yǎng)基富集HT29結(jié)腸癌干細(xì)胞,顯微鏡下觀察微球規(guī)則后,胰酶消化,制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代。3.HT29結(jié)腸癌干細(xì)胞富集效果的檢測(cè):采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT29微球中CD133的表達(dá),Western blotting檢測(cè)HT29微球中ALDH1的表達(dá);克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)HT29微球的克隆形成能力。4.將從結(jié)腸癌細(xì)胞HT29微球中提取的總蛋白通過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析后,經(jīng)Con A親和層析、DEAE離子交換層析純化gp96-肽復(fù)合物,并通過(guò)SDS-PAGE、蛋白免疫印跡對(duì)其進(jìn)行鑒定,利用BCA法測(cè)定各步所得蛋白的濃度。5.從臍血分離單個(gè)核細(xì)胞后,分別培養(yǎng)DC、CIK,DC培養(yǎng)至第5天加入純化的gp96-肽復(fù)合物,繼續(xù)培養(yǎng)72h,促進(jìn)DC成熟。于培養(yǎng)第10天將DC、CIK以1:5的比例混合培養(yǎng),繼續(xù)培養(yǎng)2-3天后采用LDH法檢測(cè)對(duì)結(jié)腸癌CSC的殺傷活性�！窘Y(jié)果】1.利用Hoechst33342熒光染料檢測(cè)HT29細(xì)胞中SP細(xì)胞的含量為3.45%±0.05%,此外,流式細(xì)胞儀分析常規(guī)培養(yǎng)的HT29中CD133+細(xì)胞的比例為45.38%±10.65%;Western blotting結(jié)果顯示,HT29貼壁細(xì)胞ALDH1蛋白表達(dá)陽(yáng)性。采用3種方法檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)的HT29貼壁細(xì)胞,均表明其存在腫瘤干細(xì)胞亞群。2.無(wú)血清懸浮培養(yǎng)7-10d,可形成規(guī)則的HT29微球,且狀態(tài)最佳;血清可以促進(jìn)HT29微球的分化;此外,HT29微球可在含血清培養(yǎng)基(SSM)和無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中交替轉(zhuǎn)化。3.HT29結(jié)腸癌干細(xì)胞富集效果的檢測(cè)顯示:HT29微球中CD133+細(xì)胞的比例高于常規(guī)培養(yǎng)的HT29細(xì)胞中CD133+的細(xì)胞比例(P0.05),HT29微球中ALDH1蛋白表達(dá)量與常規(guī)培養(yǎng)的HT29細(xì)胞相比明顯提高(P0.05),HT29微球的克隆形成率較HT29細(xì)胞明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.經(jīng)SDS-PAGE、蛋白免疫印跡鑒定從HT29微球中提取、純化出的蛋白為gp96-肽復(fù)合物。1g濕重的HT29微球經(jīng)純化后可得到純度95%的gp96-肽復(fù)合物40μg左右。5.負(fù)載gp96-肽復(fù)合物的DC與CIK共培養(yǎng)后,當(dāng)效靶比為40:1時(shí),對(duì)HT29結(jié)腸癌CSC的殺傷效果明顯,殺傷率[(33.07±2.79)%]要高于DC+CIK組[(15.20±1.67)%](P0.05)�！窘Y(jié)論】1.懸浮培養(yǎng)法可用于富集HT29結(jié)腸癌干細(xì)胞,且便于操作,適于實(shí)驗(yàn)研究。2.通過(guò)硫酸銨鹽析、Con A親和層析、DEAE離子交換層析從HT29微球中成功純化出gp96-肽復(fù)合物。3.負(fù)載gp96-肽復(fù)合物的DC-CIK可以有效地殺傷結(jié)腸癌干細(xì)胞,為腫瘤干細(xì)胞新策略的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)腸癌 腫瘤干細(xì)胞 富集 懸浮培養(yǎng) 熱休克蛋白96 純化 樹(shù)突細(xì)胞 殺傷細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明11-13
• 前言13-15
• 研究現(xiàn)狀、成果13-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、懸浮培養(yǎng)法富集結(jié)腸癌CSC15-38
• 1.1 對(duì)象和方法15-25
• 1.1.1 材料15-16
• 1.1.2 主要溶液配制16-19
• 1.1.3 實(shí)驗(yàn)方法19-25
• 1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25
• 1.2 結(jié)果25-35
• 1.2.1 常規(guī)培養(yǎng)的HT29結(jié)腸癌細(xì)胞中CSC檢測(cè)25-27
• 1.2.2 懸浮培養(yǎng)法富集結(jié)腸癌CSC27-33
• 1.2.3 HT29結(jié)腸癌CSC富集效果的檢測(cè)33-35
• 1.3 討論35-36
• 1.3.1 分選、富集腫瘤干細(xì)胞技術(shù)的選擇35-36
• 1.3.2 無(wú)血清懸浮培養(yǎng)法富集HT29結(jié)腸癌CSC實(shí)驗(yàn)總結(jié)36
• 1.4 小結(jié)36-38
• 二、負(fù)載結(jié)腸癌干細(xì)胞gp96-肽復(fù)合物DC-CIK對(duì)同源CSC殺傷作用的初步研究38-62
• 2.1 對(duì)象和方法38-54
• 2.1.1 材料38-39
• 2.1.2 主要溶液配制39-44
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)方法44-53
• 2.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析53-54
• 2.2 結(jié)果54-59
• 2.2.1 HT29微球gp96-肽復(fù)合物的提取、純化及鑒定結(jié)果54-56
• 2.2.2 gp96肽復(fù)合物誘導(dǎo)DC-CIK殺傷HT29結(jié)腸癌CSC實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-59
• 2.3 討論59-61
• 2.3.1 gp96肽復(fù)合物的提取與純化59-61
• 2.3.2 負(fù)載結(jié)腸癌干細(xì)胞gp96-肽復(fù)合物DC-CIK對(duì)同源CSC殺傷效果的實(shí)驗(yàn)總結(jié)61
• 2.4 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明67-68
• 綜述68-80
• 綜述參考文獻(xiàn)75-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 陳才偉;賈曉娟;孟頌東;劉文軍;;Gp96蛋白的免疫學(xué)及其臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2011年05期

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本文編號(hào)：993019