本文關(guān)鍵詞：下調(diào)HOTAIR表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌及其癌干細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響

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【摘要】：結(jié)直腸癌起源于粘膜上皮或粘膜下間葉組織,是由結(jié)直腸粘膜上皮在環(huán)境或遺傳等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡變,是最常見的消化道惡性腫瘤之一。在各類惡性腫瘤中,結(jié)直腸癌的發(fā)病率居第三位,占胃腸道腫瘤的第二位。結(jié)直腸癌治療以手術(shù)、放化療為主,因其極易侵犯血管、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠(yuǎn)處而增加了根治的難度。結(jié)直腸癌是上皮源性的腫瘤,上皮細(xì)胞之所以惡性病變進(jìn)而轉(zhuǎn)移,可能涉及到上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)。近年來,非編碼RNA作為表觀遺傳學(xué)研究?jī)?nèi)容之一,從小RNA到長(zhǎng)鏈非編碼RNA (LncRNA),在腫瘤中已被廣泛探究。HOX transcript antisense RNA (HOTAIR)作為L(zhǎng)ncRNA大家族的成員之一,在乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等腫瘤中已有較多的研究報(bào)道。盡管如此,HOTAIR在結(jié)直腸癌及其癌干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)中的分子生物學(xué)特性仍知之甚少。本研究選擇人結(jié)直腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞系作為研究對(duì)象,針對(duì)HOTAIR編碼基因設(shè)計(jì)合成小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA),利用RNAi的方法,將構(gòu)建好的真核ShRNA表達(dá)載體,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至LoVo細(xì)胞,來降低HOTAIR表達(dá)水平,并分選出結(jié)直腸癌CSCs,通過檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)特性改變,探討HOTAIR是否可作為結(jié)直腸癌CSCs治療的新靶點(diǎn)。目的：探討抑制結(jié)人結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞及其CSCs中HOTAIR的表達(dá),對(duì)癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響,為進(jìn)行以HOTAIR為靶點(diǎn)的結(jié)直腸癌治療提供依據(jù)。方法：以Superior-EGFP1為載體構(gòu)建的ShRNA重組質(zhì)粒,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞,經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后,用QRT-PCR檢測(cè)HOTAIR的表達(dá)。通過LoVo細(xì)胞體外增殖能力、耐藥能力、克隆形成能力、轉(zhuǎn)移侵襲能力、體內(nèi)致瘤性等實(shí)驗(yàn),綜合分析下調(diào)HOTAIR表達(dá)后對(duì)LoVo細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。進(jìn)而,通過免疫磁珠分選出結(jié)直腸癌CSCs,用上述方法及免疫組化和Western Blot方法對(duì)其侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)分子表達(dá)做進(jìn)一步分析。結(jié)果：1.RT-PCR檢測(cè)證實(shí)在結(jié)直腸癌細(xì)胞LoVo中存在HOTAIR的表達(dá)；結(jié)直腸癌CSCs高表達(dá)HOTAIR,與LoVo細(xì)胞相比,差異有顯著性意義(P0.05)。2.構(gòu)建的真核重組表達(dá)載體經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞,經(jīng)G418成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,構(gòu)建的HOTAIR-ShRNA對(duì)HOTAIR的表達(dá)有一定的抑制作用。3.通過劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、體外增殖實(shí)驗(yàn)、耐藥實(shí)驗(yàn)和致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,HOTAIR-ShRNA轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞,其遷移與侵襲性、體外增殖能力、耐藥性、克隆形成能力以及在裸鼠體內(nèi)的致瘤性均有所下降,與Scramble-ShRNA轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞及野生型細(xì)胞相比,差異有顯著性意義(P0.05或P0.01)。此外,Western Blot證明,下調(diào)HOTAIR后可增加細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá),降低波形蛋白的表達(dá)。4.經(jīng)免疫磁珠分選出CD133陽性的結(jié)直腸癌CSCs,轉(zhuǎn)染HOTAIR-ShRNA后，，與野生型及Scramble-ShRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CSCs相比,細(xì)胞的遷移與侵襲性、體外增殖能力、耐藥性、克隆形成能力以及在小鼠的致瘤性有明顯所下降,差異有顯著性意義(P0.05或P0.01)。免疫組化和Western Blot分析結(jié)果同時(shí)證明,轉(zhuǎn)染HOTAIR-ShRNA的結(jié)直腸癌CSCs,所致的裸鼠腫瘤及肺組織中EMT相關(guān)分子表達(dá)發(fā)生改變,即E-鈣黏蛋白表達(dá)升高,波形蛋白表達(dá)降低,與Scramble-ShRNA轉(zhuǎn)染的LoVo細(xì)胞及野生型細(xì)胞所致的裸鼠腫瘤及肺組織組相比,差異有顯著性意義(P0.05)。結(jié)論：1.降低人結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá),可在一定程度上降低LoVo細(xì)胞在體外的克隆形成能力、增殖能力、耐藥性、侵襲轉(zhuǎn)移能力及體內(nèi)致瘤能力,抑制LoVo細(xì)胞發(fā)生EMT。2.下調(diào)HOTAIR表達(dá)可減弱結(jié)直腸癌CD133+CSCs侵襲轉(zhuǎn)移性和致瘤性,提示HOTAIR可能是結(jié)直腸癌治療的新靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)直腸癌 HOTAIR 癌干細(xì)胞 RNA干擾 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 靶向治療
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.34
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 符號(hào)、變量、縮咯詞等本論文專用術(shù)語的注釋表9-12
• 緒論12-13
• 綜述 結(jié)直腸癌的EMT與HOTAIR的研究概況13-22
• Reference18-22
• 第一部分 下調(diào)HOTAIR在人結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞中的表達(dá)及單克隆篩選22-33
• 引言22
• 材料與方法22-28
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-32
• 討論32-33
• 第二部分 HOTAIR-shRNA對(duì)人結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響33-48
• 引言33
• 材料與方法33-39
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-47
• 討論47-48
• 第三部分 下調(diào)HOTAIR表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌干細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和致瘤性的影響48-62
• 引言48
• 材料與方法48-50
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-60
• 討論60-62
• 結(jié)論62-63
• 參考文獻(xiàn)63-64
• 致謝64-65
• 個(gè)人簡(jiǎn)介65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：992285