本文關(guān)鍵詞：乳腺癌多藥耐藥機(jī)制與標(biāo)志物的初步研究

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【摘要】：背景與目的:乳腺癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤。近幾十年來,其發(fā)病率逐年上升。每年全世界約有110多萬人被診斷為乳腺癌,而有約40多萬人死于該病[1]。在歐美國(guó)家乳腺癌占女性惡性腫瘤的25%-32%,據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)估計(jì),美國(guó)每年乳腺癌新發(fā)病例有17萬,死于乳腺癌的人數(shù)為4萬[2]。我國(guó)雖不屬于乳腺癌的高發(fā)國(guó)家,但我國(guó)患者每年平均增長(zhǎng)速度卻已經(jīng)高出高發(fā)國(guó)家2個(gè)百分點(diǎn)左右,最糟糕的情況是而且仍然以每年3%的速度遞增。在中國(guó)國(guó)內(nèi)許多超大城市里,乳腺癌發(fā)病率已然上升成為女性惡性腫瘤第一位,成為女性健康的最大威脅。有研究顯示,在我國(guó)京、津、滬及沿海一些大城市的發(fā)病率較高,上海市的發(fā)病率居全國(guó)首位,而目前天津市乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤發(fā)病的第二位,僅僅是排在肺癌之后,而且年齡性別研究發(fā)病率顯示乳腺癌發(fā)病高峰有年輕化的趨勢(shì)。目前手術(shù)、放療、化療仍然是乳腺癌的主要治療手段。輔助化學(xué)治療的使用使早期乳腺癌的生存率提高30%,然而乳腺癌發(fā)生耐藥是臨床上患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤細(xì)胞根據(jù)其獨(dú)有的耐藥特點(diǎn),可將耐藥表型分為單藥耐藥(Primary drug resistance,PDR)和多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)兩大類。而多藥耐藥和轉(zhuǎn)移的發(fā)生是無疑是臨床上腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因之一。在過去幾十年中,雖然對(duì)惡性腫瘤的這兩種特性已經(jīng)有了很廣泛的研究,但是大多數(shù)只是把其做為兩種單獨(dú)的生物學(xué)行為進(jìn)行研究。近來越來越多的研究表明這兩種表型之間的確建立著一種功能上的聯(lián)系:首先是從親本細(xì)胞中篩選出來的耐藥細(xì)胞系具有更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,此外對(duì)一些轉(zhuǎn)移性腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞比原發(fā)瘤的耐藥性明顯增強(qiáng),而這與臨床上所觀察到的發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者化療效果較差以及化療效果不好的腫瘤患者容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的結(jié)果相一致。因此,這種腫瘤細(xì)胞耐藥可以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)移能力現(xiàn)象表明,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,耐藥和轉(zhuǎn)移的進(jìn)展可能不是相互獨(dú)立的,兩種現(xiàn)象之間可能有更直接的聯(lián)系。最近一些研究表明獲得多藥耐藥的腫瘤細(xì)胞通常伴有侵襲能力增強(qiáng)的特性。幾種證據(jù)顯示多藥耐藥發(fā)生時(shí)其他信號(hào)通路的聯(lián)合激活會(huì)增加多藥耐藥癌癥細(xì)胞的侵襲潛能。然而,更精確的機(jī)制目前尚不清楚。本研究中,為了更好的理解由耐藥性引起的腫瘤形成的相關(guān)分子通路,建立了長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)在表柔比星藥物內(nèi)的p糖蛋白過表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞系sk-br-3/epr。sk-br-3/epr表現(xiàn)出來增殖活性的降低,但是同時(shí)細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。同時(shí),可以觀察到與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp-2/9)在sk-br-3/epr細(xì)胞中的表達(dá)升高。另外,sk-br-3/epr細(xì)胞中stat3的活性也提高了。stat3信號(hào)通路的激活上調(diào)了mmp-2/9的表達(dá),從而進(jìn)一步增強(qiáng)了sk-br-3/epr細(xì)胞的侵襲能力。stat3是眾所周知的癌癥基因,經(jīng)常會(huì)參與到腫瘤發(fā)生形成和對(duì)化療具有抗藥性等的過程中。本研究深入探討了潛在的多藥耐藥和腫瘤侵襲功能聯(lián)系的機(jī)制。如上所述,乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌預(yù)后不良的主要原因,1/3乳腺癌患者五年之內(nèi)會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移或者病死,如果能盡早發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移灶采取及時(shí)的治療,仍然可以是一部分患者獲得較好的療效,延長(zhǎng)患者生存期。乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一種非常復(fù)雜的機(jī)制,有很多因素調(diào)控,第一部分的研究也部分的討論了乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和多藥耐藥之間的聯(lián)系,通過查閱乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制文獻(xiàn),作者發(fā)現(xiàn)人附睪蛋白4(he4)是近年來用于卵巢癌早期篩查的腫瘤標(biāo)志物,有研究證實(shí)he4在乳腺癌中也有表達(dá),但是其在乳腺癌中的具體作用和機(jī)制研究較少。人附睪蛋白4(he4)是新型的腫瘤標(biāo)記物,在檢測(cè)卵巢癌時(shí)有很高的靈敏度和特異度。在婦科盆腔腫瘤疾病中診斷中有優(yōu)勢(shì),美國(guó)食品藥品管理局(fda)已經(jīng)批準(zhǔn)he4用于臨床監(jiān)測(cè)卵巢癌的復(fù)發(fā)與進(jìn)展,而he4在乳腺癌中的作用還鮮有報(bào)道。所以本研究旨在探討人附睪蛋白4(he4)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制研究。方法:第一部分:采用細(xì)胞培養(yǎng)和引入藥物使細(xì)胞具有抗性,采用半抑制濃度來測(cè)定抗性指數(shù),采用反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)mrna的表達(dá)水平,westernblotting(蛋白印跡法)檢測(cè)mmp-2/9、stat3、p-stat3、erk1/2、p-erk1/2蛋白表達(dá)水平,免疫熒光測(cè)定法測(cè)定sk-br-3細(xì)胞以及無表柔比星培養(yǎng)基中培養(yǎng)的sk-br-3/epr中p糖蛋白表達(dá),利用細(xì)胞增殖與克隆形成實(shí)驗(yàn)sk-br-3/epr的細(xì)胞增殖情況,細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞侵襲能力的變化。第二部分:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)15例原發(fā)乳腺癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織中HE4 mRNA的表達(dá)水平。RT-qPCR和Western blot檢測(cè)常見乳腺(癌)細(xì)胞系中HE4 mRNA和蛋白表達(dá)水平。通過RNA干擾技術(shù)沉默HE4高表達(dá)的乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞中HE4表達(dá),通過CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)分析沉默HE4表達(dá)對(duì)SK-BR-3細(xì)胞細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)沉默HE4表達(dá)對(duì)SK-BR-3細(xì)胞凋亡的影響。Western blot檢測(cè)沉默HE4表達(dá)對(duì)Erk和Akt磷酸化水平的影響。結(jié)果:第一部分:升高P-糖蛋白表達(dá)量,SK-BR-3/EPR會(huì)獲得多藥耐藥表型;SK-BR-3/EPR在隨后沒有表柔比星的培養(yǎng)基里連續(xù)培養(yǎng)六周后還具有多藥耐藥的表型;SK-BR-3/EPR細(xì)胞在細(xì)胞增殖率方面有顯著減低,而侵襲能力卻表現(xiàn)出增強(qiáng);SK-BR-3/EPR中MMP2/9表達(dá)上調(diào);SK-BR-3/EPR細(xì)胞中磷酰化和STAT3的激活增加;STAT3的敲減抑制了細(xì)胞的侵襲能力同時(shí)也下調(diào)了SK-BR-3/EPR細(xì)胞中MMP2/9的表達(dá)。第二部分:HE4 mRNA在乳腺癌組織中高表達(dá);沉默HE4表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3細(xì)胞增殖能力,并促進(jìn)其凋亡,Erk和Akt蛋白磷酸化水平降低。結(jié)論:1、成功建立了P糖蛋白過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3/EPR。2、SK-BR-3/EPR細(xì)胞表現(xiàn)出侵襲能力增強(qiáng)的特性,同時(shí)細(xì)胞中MMP-2/9的表達(dá)上調(diào)。3、STAT3信號(hào)介導(dǎo)了MMP-2/9的表達(dá)上調(diào),增強(qiáng)SK-BR-3/EPR乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。4、SK-BR-3細(xì)胞的增殖和凋亡與HE4的表達(dá)相關(guān)。5、HE4影響Erk和Akt的磷酸化水平。
【關(guān)鍵詞】：侵襲 多藥耐藥 乳腺癌 STAT3 MMP-2 MMP-9 HE4
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-15
• 縮略語15-16
• 前言16-24
• 研究現(xiàn)狀、成果16-22
• 研究目的、方法22-24
• 一、乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)初步研究24-42
• 1.1 對(duì)象和方法24-25
• 1.1.1 試劑和藥品24
• 1.1.2 主要儀器設(shè)備24-25
• 1.2 技術(shù)路線25-26
• 1.3 方法26-29
• 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和抗性引入26-27
• 1.3.2 半抑制濃度實(shí)驗(yàn)27
• 1.3.3 反轉(zhuǎn)錄和定量PCR27-28
• 1.3.4 Western Blotting28
• 1.3.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)28
• 1.3.6 羅丹明 123（Rh123）染料流出實(shí)驗(yàn)28
• 1.3.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)與克隆形成實(shí)驗(yàn)28-29
• 1.3.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)29
• 1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29
• 1.4 結(jié)果29-38
• 1.4.1 建立多藥耐藥（MDR）SK-BR-3/EPR細(xì)胞29-30
• 1.4.2 在SK-BR-3/EPR細(xì)胞中多藥耐藥表型的獲得依賴于P-糖蛋白的高表達(dá)30-31
• 1.4.3 SK-BR-3/EPR細(xì)胞在無表柔比星培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)6周仍保持有多藥耐藥的表型31-33
• 1.4.4 SK-BR-3/EPR細(xì)胞增殖能力顯著降低，，細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)33-34
• 1.4.5 SK-BR-3/EPR細(xì)胞中MMP-2/9 的表達(dá)上調(diào)34-36
• 1.4.6 多藥耐藥SK-BR-3/EPR細(xì)胞中STAT3磷酸化和活化水平提高36
• 1.4.7 SK-BR-3/EPR細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)依賴于MMP-2/9 的表達(dá)上調(diào)36-38
• 1.5 討論38-40
• 1.6 小結(jié)40-42
• 二、乳腺癌腫瘤標(biāo)記物的初步研究42-55
• 2.1 對(duì)象和方法42-43
• 2.1.1 組織標(biāo)本獲得42
• 2.1.2 主要試劑和藥品42
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備42-43
• 2.2 技術(shù)路線43
• 2.3 方法43-49
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)43-44
• 2.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染44-45
• 2.3.3 RNA的提取45-46
• 2.3.4 逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR46
• 2.3.5 Western blot46-48
• 2.3.6 CCK-8 實(shí)驗(yàn)48
• 2.3.7 克隆形成48
• 2.3.8 流式細(xì)胞術(shù)48-49
• 2.4 結(jié)果49-52
• 2.4.1 HE4在乳腺原位癌組織中的表達(dá)水平增高49
• 2.4.2 HE4在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平增高49-50
• 2.4.3 獲得HE4降表達(dá)的SK-BR-3 細(xì)胞50-51
• 2.4.4 HE4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖51
• 2.4.5 HE4抑制細(xì)胞凋亡51-52
• 2.5 討論52-53
• 2.6 小結(jié)53-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-65
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明65-66
• 綜述 Rack1在蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方面作用研究66-79
• 綜述參考文獻(xiàn)74-79
• 致謝79-80
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷80

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