本文關鍵詞：乳腺癌多藥耐藥機制與標志物的初步研究

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【摘要】：背景與目的:乳腺癌是一種嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤。近幾十年來,其發(fā)病率逐年上升。每年全世界約有110多萬人被診斷為乳腺癌,而有約40多萬人死于該病[1]。在歐美國家乳腺癌占女性惡性腫瘤的25%-32%,據(jù)美國癌癥協(xié)會估計,美國每年乳腺癌新發(fā)病例有17萬,死于乳腺癌的人數(shù)為4萬[2]。我國雖不屬于乳腺癌的高發(fā)國家,但我國患者每年平均增長速度卻已經(jīng)高出高發(fā)國家2個百分點左右,最糟糕的情況是而且仍然以每年3%的速度遞增。在中國國內許多超大城市里,乳腺癌發(fā)病率已然上升成為女性惡性腫瘤第一位,成為女性健康的最大威脅。有研究顯示,在我國京、津、滬及沿海一些大城市的發(fā)病率較高,上海市的發(fā)病率居全國首位,而目前天津市乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤發(fā)病的第二位,僅僅是排在肺癌之后,而且年齡性別研究發(fā)病率顯示乳腺癌發(fā)病高峰有年輕化的趨勢。目前手術、放療、化療仍然是乳腺癌的主要治療手段。輔助化學治療的使用使早期乳腺癌的生存率提高30%,然而乳腺癌發(fā)生耐藥是臨床上患者治療失敗和死亡的主要原因。腫瘤細胞根據(jù)其獨有的耐藥特點,可將耐藥表型分為單藥耐藥(Primary drug resistance,PDR)和多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)兩大類。而多藥耐藥和轉移的發(fā)生是無疑是臨床上腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因之一。在過去幾十年中,雖然對惡性腫瘤的這兩種特性已經(jīng)有了很廣泛的研究,但是大多數(shù)只是把其做為兩種單獨的生物學行為進行研究。近來越來越多的研究表明這兩種表型之間的確建立著一種功能上的聯(lián)系:首先是從親本細胞中篩選出來的耐藥細胞系具有更強的侵襲和轉移能力,此外對一些轉移性腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)轉移灶細胞比原發(fā)瘤的耐藥性明顯增強,而這與臨床上所觀察到的發(fā)生轉移的腫瘤患者化療效果較差以及化療效果不好的腫瘤患者容易出現(xiàn)轉移的結果相一致。因此,這種腫瘤細胞耐藥可以增強其轉移能力現(xiàn)象表明,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,耐藥和轉移的進展可能不是相互獨立的,兩種現(xiàn)象之間可能有更直接的聯(lián)系。最近一些研究表明獲得多藥耐藥的腫瘤細胞通常伴有侵襲能力增強的特性。幾種證據(jù)顯示多藥耐藥發(fā)生時其他信號通路的聯(lián)合激活會增加多藥耐藥癌癥細胞的侵襲潛能。然而,更精確的機制目前尚不清楚。本研究中,為了更好的理解由耐藥性引起的腫瘤形成的相關分子通路,建立了長時間培養(yǎng)在表柔比星藥物內的p糖蛋白過表達的人乳腺癌細胞系sk-br-3/epr。sk-br-3/epr表現(xiàn)出來增殖活性的降低,但是同時細胞的侵襲能力增強。同時,可以觀察到與腫瘤轉移相關的基質金屬蛋白酶(mmp-2/9)在sk-br-3/epr細胞中的表達升高。另外,sk-br-3/epr細胞中stat3的活性也提高了。stat3信號通路的激活上調了mmp-2/9的表達,從而進一步增強了sk-br-3/epr細胞的侵襲能力。stat3是眾所周知的癌癥基因,經(jīng)常會參與到腫瘤發(fā)生形成和對化療具有抗藥性等的過程中。本研究深入探討了潛在的多藥耐藥和腫瘤侵襲功能聯(lián)系的機制。如上所述,乳腺癌的復發(fā)轉移是造成乳腺癌預后不良的主要原因,1/3乳腺癌患者五年之內會出現(xiàn)復發(fā)轉移或者病死,如果能盡早發(fā)現(xiàn)復發(fā)轉移灶采取及時的治療,仍然可以是一部分患者獲得較好的療效,延長患者生存期。乳腺癌的復發(fā)轉移是一種非常復雜的機制,有很多因素調控,第一部分的研究也部分的討論了乳腺癌復發(fā)轉移和多藥耐藥之間的聯(lián)系,通過查閱乳腺癌復發(fā)轉移機制文獻,作者發(fā)現(xiàn)人附睪蛋白4(he4)是近年來用于卵巢癌早期篩查的腫瘤標志物,有研究證實he4在乳腺癌中也有表達,但是其在乳腺癌中的具體作用和機制研究較少。人附睪蛋白4(he4)是新型的腫瘤標記物,在檢測卵巢癌時有很高的靈敏度和特異度。在婦科盆腔腫瘤疾病中診斷中有優(yōu)勢,美國食品藥品管理局(fda)已經(jīng)批準he4用于臨床監(jiān)測卵巢癌的復發(fā)與進展,而he4在乳腺癌中的作用還鮮有報道。所以本研究旨在探討人附睪蛋白4(he4)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的機制研究。方法:第一部分:采用細胞培養(yǎng)和引入藥物使細胞具有抗性,采用半抑制濃度來測定抗性指數(shù),采用反轉錄和實時定量pcr檢測mrna的表達水平,westernblotting(蛋白印跡法)檢測mmp-2/9、stat3、p-stat3、erk1/2、p-erk1/2蛋白表達水平,免疫熒光測定法測定sk-br-3細胞以及無表柔比星培養(yǎng)基中培養(yǎng)的sk-br-3/epr中p糖蛋白表達,利用細胞增殖與克隆形成實驗sk-br-3/epr的細胞增殖情況,細胞侵襲實驗驗證細胞侵襲能力的變化。第二部分:采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測15例原發(fā)乳腺癌組織及其配對的癌旁正常組織中HE4 mRNA的表達水平。RT-qPCR和Western blot檢測常見乳腺(癌)細胞系中HE4 mRNA和蛋白表達水平。通過RNA干擾技術沉默HE4高表達的乳腺癌SK-BR-3細胞中HE4表達,通過CCK-8和克隆形成實驗分析沉默HE4表達對SK-BR-3細胞細胞增殖的影響。流式細胞術檢測沉默HE4表達對SK-BR-3細胞凋亡的影響。Western blot檢測沉默HE4表達對Erk和Akt磷酸化水平的影響。結果:第一部分:升高P-糖蛋白表達量,SK-BR-3/EPR會獲得多藥耐藥表型;SK-BR-3/EPR在隨后沒有表柔比星的培養(yǎng)基里連續(xù)培養(yǎng)六周后還具有多藥耐藥的表型;SK-BR-3/EPR細胞在細胞增殖率方面有顯著減低,而侵襲能力卻表現(xiàn)出增強;SK-BR-3/EPR中MMP2/9表達上調;SK-BR-3/EPR細胞中磷�；蚐TAT3的激活增加;STAT3的敲減抑制了細胞的侵襲能力同時也下調了SK-BR-3/EPR細胞中MMP2/9的表達。第二部分:HE4 mRNA在乳腺癌組織中高表達;沉默HE4表達抑制乳腺癌細胞SK-BR-3細胞增殖能力,并促進其凋亡,Erk和Akt蛋白磷酸化水平降低。結論:1、成功建立了P糖蛋白過表達的乳腺癌細胞系SK-BR-3/EPR。2、SK-BR-3/EPR細胞表現(xiàn)出侵襲能力增強的特性,同時細胞中MMP-2/9的表達上調。3、STAT3信號介導了MMP-2/9的表達上調,增強SK-BR-3/EPR乳腺癌細胞的侵襲能力。4、SK-BR-3細胞的增殖和凋亡與HE4的表達相關。5、HE4影響Erk和Akt的磷酸化水平。
【關鍵詞】：侵襲 多藥耐藥 乳腺癌 STAT3 MMP-2 MMP-9 HE4
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-15
• 縮略語15-16
• 前言16-24
• 研究現(xiàn)狀、成果16-22
• 研究目的、方法22-24
• 一、乳腺癌多藥耐藥細胞侵襲能力增強初步研究24-42
• 1.1 對象和方法24-25
• 1.1.1 試劑和藥品24
• 1.1.2 主要儀器設備24-25
• 1.2 技術路線25-26
• 1.3 方法26-29
• 1.3.1 細胞培養(yǎng)和抗性引入26-27
• 1.3.2 半抑制濃度實驗27
• 1.3.3 反轉錄和定量PCR27-28
• 1.3.4 Western Blotting28
• 1.3.5 免疫熒光實驗28
• 1.3.6 羅丹明 123（Rh123）染料流出實驗28
• 1.3.7 細胞增殖實驗與克隆形成實驗28-29
• 1.3.8 細胞侵襲實驗29
• 1.3.9 統(tǒng)計學分析29
• 1.4 結果29-38
• 1.4.1 建立多藥耐藥（MDR）SK-BR-3/EPR細胞29-30
• 1.4.2 在SK-BR-3/EPR細胞中多藥耐藥表型的獲得依賴于P-糖蛋白的高表達30-31
• 1.4.3 SK-BR-3/EPR細胞在無表柔比星培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)6周仍保持有多藥耐藥的表型31-33
• 1.4.4 SK-BR-3/EPR細胞增殖能力顯著降低，，細胞的侵襲能力增強33-34
• 1.4.5 SK-BR-3/EPR細胞中MMP-2/9 的表達上調34-36
• 1.4.6 多藥耐藥SK-BR-3/EPR細胞中STAT3磷酸化和活化水平提高36
• 1.4.7 SK-BR-3/EPR細胞侵襲能力增強依賴于MMP-2/9 的表達上調36-38
• 1.5 討論38-40
• 1.6 小結40-42
• 二、乳腺癌腫瘤標記物的初步研究42-55
• 2.1 對象和方法42-43
• 2.1.1 組織標本獲得42
• 2.1.2 主要試劑和藥品42
• 2.1.3 主要儀器設備42-43
• 2.2 技術路線43
• 2.3 方法43-49
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)43-44
• 2.3.2 細胞轉染44-45
• 2.3.3 RNA的提取45-46
• 2.3.4 逆轉錄熒光定量PCR46
• 2.3.5 Western blot46-48
• 2.3.6 CCK-8 實驗48
• 2.3.7 克隆形成48
• 2.3.8 流式細胞術48-49
• 2.4 結果49-52
• 2.4.1 HE4在乳腺原位癌組織中的表達水平增高49
• 2.4.2 HE4在乳腺癌細胞中表達水平增高49-50
• 2.4.3 獲得HE4降表達的SK-BR-3 細胞50-51
• 2.4.4 HE4促進乳腺癌細胞的增殖51
• 2.4.5 HE4抑制細胞凋亡51-52
• 2.5 討論52-53
• 2.6 小結53-55
• 結論55-56
• 參考文獻56-65
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明65-66
• 綜述 Rack1在蛋白質合成和細胞運動方面作用研究66-79
• 綜述參考文獻74-79
• 致謝79-80
• 個人簡歷80

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