本文關(guān)鍵詞：Rab25在非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼獲得性耐藥中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：一、研究背景近年來(lái)肺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢(shì),而這一趨勢(shì)在中國(guó)尤其明顯。據(jù)報(bào)道,肺癌在我國(guó)已經(jīng)成為發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤,對(duì)人群健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。而在肺癌病例中,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占據(jù)了絕大部分。不幸的是,將近80%的NSCLC病人被診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期。他們不像早期病人能通過(guò)手術(shù)等治療獲得較高的生存率,臨床上對(duì)這些病人的治療手段也是很有限的。厄洛替尼(erlotinib)作為表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)給晚期NSCLC病人,特別是對(duì)EGFR敏感突變的病人帶來(lái)了巨大的希望。但是,幾乎所有的病人在用藥半年到一年時(shí)會(huì)產(chǎn)生厄洛替尼耐藥。盡管現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種因素參與了耐藥的發(fā)生,但仍有30%左右的病人耐藥的原因尚不清楚。因此,對(duì)NSCLC發(fā)生EGFR-TKI獲得性耐藥機(jī)制的進(jìn)一步探索是當(dāng)前本領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。Rab25是一種分布在上皮細(xì)胞的小GTP酶,其異常表達(dá)與包括肺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道利用基因芯片的方法研究發(fā)現(xiàn)Rab25可能與厄洛替尼等3種TKI耐藥都相關(guān)[1],但其在NSCLC厄洛替尼獲得性耐藥中的作用和機(jī)制有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與調(diào)控多種腫瘤的增殖分化及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為[2]。研究表明,在肺腺癌NCI-H1650細(xì)胞中,EGFR的突變特別是T790M突變能磷酸化并激活β-catenin,從而介導(dǎo)核內(nèi)反式激活,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)厄洛替尼的敏感性下降[3]。而敲低β-catenin的表達(dá)能夠明顯改善非敏感的肺腺癌H1975細(xì)胞對(duì)不可逆性TKI(BIBW2992)的敏感性[4]。這些證據(jù)都表明,β-catenin在TKI原發(fā)和繼發(fā)性耐藥中可能發(fā)揮了一定的作用。而β-catenin在PC9/ER細(xì)胞中是否也是Rab25介導(dǎo)的厄洛替尼敏感性的下游機(jī)制引起了我們的研究興趣。二、研究目的研究Rab25在厄洛替尼耐藥細(xì)胞(PC9/ER)與親本細(xì)胞中的表達(dá)差異;通過(guò)基因敲低手段明確其在NSCLC發(fā)生厄洛替尼獲得性耐藥中的作用,以期為豐富對(duì)厄洛替尼耐藥的認(rèn)識(shí)提供新思路、新理念。三、研究方法1.在課題組前期誘導(dǎo)獲得的耐藥細(xì)胞PC9/ER基礎(chǔ)上,傳代培養(yǎng)并比較其與親本細(xì)胞PC9在形態(tài)上的差異;利用CCK-8法鑒定PC9/ER細(xì)胞的耐藥性,并計(jì)算耐藥指數(shù)。2.利用qPCR和Western-Blot比較Rab25在PC9/ER及PC9細(xì)胞間基因和蛋白表達(dá)水平的差異;利用梯度厄洛替尼濃度刺激兩株細(xì)胞,比較兩者Rab25蛋白水平變化及劑量依賴效應(yīng);利用免疫熒光法定位Rab25蛋白在兩者細(xì)胞定位的不同。3.利用siRNA和慢病毒(LV)轉(zhuǎn)染技術(shù),敲低Rab25在PC9/ER細(xì)胞中的表達(dá),研究Rab25敲減對(duì)改善厄洛替尼耐藥的作用;運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)敲減組與對(duì)照組的細(xì)胞周期變化,明確Rab25敲低對(duì)細(xì)胞增殖特性的作用。4.在PC9/ER細(xì)胞敲低Rab25表達(dá)的基礎(chǔ)上,用Western-Blot探索Wnt信號(hào)通路蛋白的改變狀態(tài),并運(yùn)用激動(dòng)劑LiCl對(duì)信號(hào)通路恢復(fù)活性以檢測(cè)PC9/ER細(xì)胞對(duì)厄洛替尼敏感性的變化。四、研究結(jié)果1.傳代培養(yǎng)的PC9/ER及PC9細(xì)胞,在低倍鏡下觀察到:PC9細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形,而PC9/ER細(xì)胞呈類圓形;高倍鏡下觀察到:PC9細(xì)胞呈散在分布,PC9/ER細(xì)胞呈連續(xù)片狀分布。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明,PC9/ER細(xì)胞的IC50值遠(yuǎn)高于PC9細(xì)胞[(7.85±1.53)μM vs(0.12±0.04)μM,P0.01)],PC9/ER細(xì)胞的耐藥指數(shù)為68.21±21.42,提示耐藥細(xì)胞PC9/ER可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.同等厄洛替尼濃度刺激條件下,Rab25的基因和蛋白表達(dá)在PC9/ER細(xì)胞均高于PC9細(xì)胞(P0.05);增高的Rab25蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜;在PC9及PC9/ER細(xì)胞中,Rab25的蛋白水平在0-1μM厄洛替尼之間隨刺激濃度的遞增而增高。3.成功篩選si Rab25序列并轉(zhuǎn)染PC9/ER細(xì)胞并敲低Rab25的表達(dá),敲低組的IC50明顯低于對(duì)照組[(0.59±0.33)vs(6.14±0.92)μM,P0.05];敲低組的增殖指數(shù)明顯低于對(duì)照組[(0.53±0.10)vs(0.89±0.06),P0.05]。4.厄洛替尼作用于PC9/ER細(xì)胞后,β-catenin蛋白水平明顯高于PC9細(xì)胞(P0.05);免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-catenin主要表達(dá)于細(xì)胞核;β-catenin和p-GSK-3β蛋白水平在LV-Rab25組低于LV-control組;而Li Cl(10m M)能在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中升高LV-Rab25組細(xì)胞的β-catenin表達(dá)。五、結(jié)論1.Rab25在PC9/ER細(xì)胞中高表達(dá),對(duì)其厄洛替尼耐藥具有促進(jìn)作用。2.Wnt信號(hào)通路的激活,導(dǎo)致β-catenin的核表達(dá)增加,在Rab25介導(dǎo)的PC9細(xì)胞厄洛替尼耐藥發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：Rab25 非小細(xì)胞肺癌 靶向治療 酪氨酸激酶抑制劑 厄洛替尼 耐藥 Wnt信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-12
• 第二章 PC9細(xì)胞獲得性耐藥與Rab25表達(dá)的相關(guān)性12-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料12-14
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法14-20
• 2.3 研究結(jié)果20-25
• 2.4 討論25-27
• 第三章 敲低Rab25能部分改善PC9/ER細(xì)胞的敏感性27-35
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 3.3 研究結(jié)果31-33
• 3.4 討論33-35
• 第四章 Wnt信號(hào)通路激活參與Rab25介導(dǎo)耐藥的機(jī)制35-44
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料35-36
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法36-38
• 4.3 研究結(jié)果38-42
• 4.4 討論42-44
• 全文結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 文獻(xiàn)綜述 Rab25在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展49-62
• 參考文獻(xiàn)57-62
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文62-63
• 致謝63-64

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 羅俊華;李娟;;厄洛替尼治療老年晚期NSCLC的臨床觀察[J];腫瘤防治研究;2009年03期

2 陳光;鞠春梅;許淼;;厄洛替尼治療老年晚期NSCLC 36例臨床評(píng)價(jià)[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2009年12期

3 ;藥品警戒信息[J];中國(guó)藥物警戒;2009年09期

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5 白皓;韓寶惠;;厄洛替尼治療非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移初步分析[J];中國(guó)肺癌雜志;2009年12期

6 李華榮;孫W毞，

本文編號(hào)：987824