本文關鍵詞：miR-145靶向調控CDK6抑制肝細胞癌生長和轉移的研究

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【摘要】：研究背景肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是最常見的惡性腫瘤之一,位居全球惡性腫瘤第五位,。在所有惡性腫瘤中,HCC的死亡率位居第三位,每年有大約60萬人死于HCC。目前,臨床上公認的HCC治療方式主要是以手術和放化療治療為核心的綜合治療方案,但是由于HCC惡性程度高,且當患者確診時患有HCC時常已是中晚期,錯過了最佳治療時間。由于HCC死亡率較高,被認為是一個多種因素參與的與多種基因有關的復雜的疾病。癌基因和抑癌基因等的異常表達和多條信號通路以及生長因子的激活參與了HCC的發(fā)生發(fā)展過程。研究HCC發(fā)病機制、尋找新的臨床診斷標記物和治療靶點是具有重要意義。mi RNA是一類內源性非編碼小RNA分子,長度約為21-23 nt。mi RNA的主要生物學功能是在轉錄后水平上對調節(jié)基因的表達,結合靶基因的3’非翻譯區(qū)(3`UTR)的,調控降解靶基因的mRNA或者抑制蛋白質的翻譯。miRNA介導的細胞調控幾乎涉及參與全部的細胞進程,包括早期發(fā)育以及細胞的增殖、分化、凋亡和細胞周期、代謝等。近年來,許多研究表明mi RNA在各種腫瘤組織中的表達異常,可能發(fā)揮了癌基因或者是抑癌基因的功能,這提示miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。因此深入研究mi RNA在腫瘤中的生物學功能以及在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機制具有重要意義,有利于腫瘤的臨床診斷和預后治療。CDK6屬于絲氨酸蘇氨酸激酶家族。CDK6編碼細胞周期依賴性蛋白激酶6主要通過與周期蛋白CCND1和CDK4結合,從而在CDK6激活后,促進轉錄因子和Rb的磷酸化,促進細胞周期的進程,在細胞的增殖和分化發(fā)揮重要的調控作用,然而它與肝癌的發(fā)生發(fā)展以及預后的關系目前還不是很清楚。研究目的檢測mi R-145在不同肝癌細胞株、肝癌組織及癌旁組織中的表達水平,體外研究mi R-145對肝癌細胞株增殖及侵襲遷移的影響,采用生物信息學軟件分析mi R-145下游靶基因并研究靶基因CDK6在肝癌組織中的表達情況。研究方法1、首先選取4個肝癌細胞系hepg2、hle、h2p、smmc及正常肝細胞系l0-2,采用熒光定量pcr方法檢測mir-145的表達差異。同時檢測mir-145在肝癌組織及癌旁組織中的表達差異。2、將mir-145mimic和mir-nc分別使用脂質體lipofectamine2000轉染hle和smmc細胞,轉染mir-nc作為陰性對照組。real-timepcr檢測轉染后mir-145的表達情況。cck8法檢測mir-145對hle和smmc細胞增殖的影響并繪制生長曲線;transwell實驗檢測mir-145對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響。3、運用生物信息學分析的方法,預測mir-145下游的靶基因并用雙熒光素酶報告基因檢測進行驗證。mir-145mimic轉染hle和smmc細胞,用real-timepcr和westernblot檢測下游靶基因cdk6的表達水平。4、采用熒光定量pcr檢測50例hcc組織以及癌旁組織中cdk6的表達情況。對之前測得的肝癌組織中mir-145表達量與cdk6的表達量進行相關性分析,分析mir-145和cdk6之間的關系。研究結果:1、real-timepcr檢測肝癌細胞系中mir-145的表達量,其明顯低于人正常肝細胞l0-2細胞(p0.05)。50例肝癌組織中mir-145相對表達量為1.9943±0.8400,明顯低于癌旁組織2.8222±0.8052(p0.001)。2、hle和smmc細胞轉染mir-145mimic后real-timepcr檢測證實mir-145成功過表達。cck8結果顯示:肝癌細胞過表達mir-14548h后,活細胞數量明顯低于對照組(p0.01)。肝癌細胞smmc和hle過表達mir-145后,細胞侵襲能力分別為對照組的48%和48%,遷移能力降為對照組的67%和54%,兩者均有統(tǒng)計學差異(p0.01)。3、用生物信息學軟件對mir-145的潛在靶基因進行了預測,雙熒光素酶方法證實mrnacdk6為mir-145的下游作用靶點之一。real-timepcr和westernblot均證實mir-145過表達后,cdk6的表達量明顯下調。4、采用real-timepcr檢測肝癌組織中cdk6相對表達量為2.7910±1.6093,明顯高于癌旁組織1.7082±0.9804,結果有統(tǒng)計學差異(p0.001)。我們對肝癌組織中mir-145表達及cdk6的表達水平進行相關性分析,分析結果表明mir-145與cdk6的表達呈負相關,結果具有統(tǒng)計學意義(r=-0.257,p0.01)。結論:1、miR-145在肝癌細胞株及肝癌組織中明顯低表達。miR-145過表達可以顯著抑制肝癌細胞株SMMC和HLE細胞的增殖,侵襲及遷移能力。miR-145可作為一個臨床診斷的候選標志物。2、m RNA CDK6為mi R-145的下游作用靶點之一。mi R-145可以靶向負調控SMMC和HLE細胞中CDK6的表達水平。3、CDK6在肝癌組織中高表達,且與miR-145的表達呈負相關。mi R-145-CDK6介導的信號通路可能在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。
【關鍵詞】：mi R-145 CDK6 肝癌 增殖 侵襲 遷移
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 mi R-145抑制肝細胞癌生長和轉移的實驗研究14-29
• 2.1 實驗材料和方法15-23
• 2.2 實驗結果23-26
• 2.3 討論26-28
• 2.4 小結28-29
• 第三章 mi R-145調控CDK6的表達的實驗研究29-42
• 3.1 實驗材料和方法29-36
• 3.2 實驗結果36-39
• 3.3 討論39-41
• 3.4 小結41-42
• 全文總結42-43
• 參考文獻43-50
• 文獻綜述 淺析Micro RNAs在惡性腫瘤中的作用:抑癌或致癌？50-60
• 參考文獻56-60
• 攻讀碩士學位期間撰寫及發(fā)表的論文60-61
• 致謝61

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