本文關(guān)鍵詞：食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的功能研究

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【摘要】：食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)是我國(guó)食管癌的主要病理類型。其易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差,目前食管癌的治療主要為放化療,所以需要研究一種新的治療食管癌治療的方法,提高治療效果。原兒茶酸乙酯(Ethyl-3,4-dihydroxybenzoate, EDHB)主要存在與植物根、葉部位,具有一定的抗氧化作用,能作為α-酮戊二酸的底物類似物抑制膠原的合成。前期研究發(fā)現(xiàn),原兒茶酸乙酯(EHDB)可以誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡和自噬,食管癌細(xì)胞經(jīng)EHDB處理后醛酮還原酶(AKR)亞家族AKR1C基因表達(dá)顯著升高。AKR亞家族是藥物和體內(nèi)毒素代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶,參與稠環(huán)芳香烴的代謝,與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性相關(guān)。目前研究發(fā)現(xiàn)AKR超家族的AKR1C亞家族高度保守,包含AKR1C1-AKR1C4分子量約34-37kDa的4個(gè)同工酶。本研究旨在探索AKR1C促進(jìn)EDHB誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞死亡的分子機(jī)理。首先,篩選了差異表達(dá)AKR1C的食管癌細(xì)胞系,含高表達(dá)AKR1C的食管癌細(xì)胞KYSE 180和低表達(dá)AKR1C的食管癌細(xì)胞KYSE 510。經(jīng)EDHB處理后,食管癌細(xì)胞增殖受到抑制,抑制效應(yīng)具有濃度和時(shí)間依賴性,表現(xiàn)為對(duì)高表達(dá)AKR1C的食管癌細(xì)胞EDHB抑制效應(yīng)更為明顯。由于尚無(wú)有效區(qū)分每一種AKR1C家族成員適用的抗體,因此選擇定量蛋白質(zhì)組多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)技術(shù),以抗體非依賴的方式監(jiān)測(cè)EDHB處理后AKR1C亞家族各個(gè)成員的變化,從而鑒定促進(jìn)EDHB作用的AKR1C有效亞型。結(jié)果顯示,EDHB處理的KYSE 180細(xì)胞中AKR1C1/C2表達(dá)增加,進(jìn)一步用siRNA敲降A(chǔ)KR1C1/C2后降了食管癌細(xì)胞對(duì)EDHB的敏感性。EDHB處理后,AKR1C1/C2促進(jìn)EDHB代謝；NDRG1表達(dá)升高,caspase-3和caspase-9活化細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源凋亡；同時(shí)BNIP3、 Beclin和LC3-Ⅱ表達(dá)升高,提示細(xì)胞發(fā)生自噬；自噬抑制劑3-MA與EDHB共同處理后,細(xì)胞凋亡更明顯。與KYSE 510相比,AKR1C1/C2促進(jìn)EDHB誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡和自噬�？傊�,EDHB處理食管癌細(xì)胞后AKR1C1/C2表達(dá)升高,AKR1C1/C2通過(guò)代謝EDHB,增加食管癌細(xì)胞對(duì)EDHB的敏感性和食管癌細(xì)胞的死亡。所以EDHB可能作為高表達(dá)AKR1C1/C2的食管鱗狀細(xì)胞癌病人的潛在的藥物。上皮間葉轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤獲得遷移能力和耐藥性的重要的生物學(xué)特征。富含嘌呤元件結(jié)合蛋白α(Purine-rich element binding protein alpha, PURa)能夠直接或間接與DNA結(jié)合發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的功能并與腫瘤相關(guān)基因表達(dá)有關(guān),同時(shí)PURa也可以與RNA結(jié)合調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)。前期研究發(fā)現(xiàn)在食管癌中過(guò)表達(dá)PURa后可以引起食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT。本文旨在研究PURa促進(jìn)食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT的分子機(jī)理。首先在不同的食管癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PURa,檢測(cè)到Snail和N-cadherin的表達(dá)升高、E-cadherin的表達(dá)降低；敲降PURa后,檢測(cè)到EMT標(biāo)志分子Snail和N-cadherin的表達(dá)量降低,證明PURa可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變。通過(guò)RNA-seq分析穩(wěn)定過(guò)表達(dá)PURa的食管癌細(xì)胞及其對(duì)照細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)PURa后,WNT5A、 LEF1和SNAI基因表達(dá)顯著升高,P-catenin由胞漿定位轉(zhuǎn)向胞核定位,提示W(wǎng)NT信號(hào)通路的活化；另外,SNAI基因下游的靶基因,包括介導(dǎo)細(xì)胞間緊密連接和粘附連接的一些分子表達(dá)明顯降低,增加了細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力�？傊�,PURa通過(guò)活化WNT信號(hào)通路,引起轉(zhuǎn)錄因子SNAI的表達(dá)升高,調(diào)節(jié)下游介導(dǎo)細(xì)胞間緊密連接和粘附連接的分子表達(dá)下調(diào),促進(jìn)了食管癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。所以,腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)PURa是導(dǎo)致食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因,為食管鱗狀細(xì)胞癌的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗狀細(xì)胞癌 原兒茶酸乙酯 AKR1C1/C2 MRM PURα 上皮間葉轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)索引表8-10
• 摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 第一部分 AKR1C1/C2促進(jìn)原兒茶酸乙酯誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞死亡機(jī)理的研究14-54
• 引言16-18
• 材料和方法18-32
• 一、材料18-22
• 二、方法22-32
• 結(jié)果32-47
• 1. 食管癌細(xì)胞中AKR1C差異表達(dá)影響EDHB的敏感性食管癌32-35
• 2. 用MRM蛋白質(zhì)組分析策略鑒定EDHB處理后AKR1C家族變化35-38
• 3. 敲降A(chǔ)KR1C1/C2降低食管癌細(xì)胞對(duì)EDHB的敏感性38-41
• 4. AKR1C1/C2促進(jìn)EDHB誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞凋亡41-43
• 5. AKR1C1/C2促進(jìn)EDHB誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞自噬43-44
• 6. EDHB與自噬抑制劑聯(lián)合使用促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖抑制44-47
• 討論47-50
• 小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-54
• 第二部分 PURα促進(jìn)食管癌細(xì)胞EMT分子機(jī)理研究54-94
• 引言56-58
• 材料和方法58-68
• 一、材料58-60
• 二. 方法60-68
• 結(jié)果68-83
• 1. PURα在食管癌細(xì)胞中的定位68-69
• 2. PURα過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)多種食管癌細(xì)胞發(fā)生EMT改變69-70
• 3. PURα過(guò)表達(dá)穩(wěn)定食管癌細(xì)胞系的構(gòu)建70-71
• 4. KYSE510-PURα-1穩(wěn)定細(xì)胞中檢測(cè)EMT改變71-72
• 5. KYSE510-PURα-1穩(wěn)定細(xì)胞中檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)72-73
• 6. KYSE510-PURα-1穩(wěn)定細(xì)胞中檢測(cè)細(xì)胞的遷移73
• 7. KYSE 510-PURα-1穩(wěn)定細(xì)胞中檢測(cè)細(xì)胞的侵襲73-74
• 8. siRNA敲降PURA基因抑制食管癌細(xì)胞EMT74-76
• 9. PURα過(guò)表達(dá)的食管癌細(xì)胞RNA-seq分析76-83
• 討論83-89
• 小結(jié)89-90
• 參考文獻(xiàn)90-94
• 文獻(xiàn)綜述94-102
• 參考文獻(xiàn)99-102
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷102-105
• 致謝105-106
• 研究生期間發(fā)表的論文和獲獎(jiǎng)證書(shū)106-134

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