發(fā)布時間：2017-10-05 15:45

  本文關(guān)鍵詞：靶向Survivin基因miRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

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【摘要】：目的：靶向Survivin基因的微小]RNA(microRNA,miRNA)真核表達(dá)載體的構(gòu)建以及探討其對人結(jié)腸癌(HT-29)細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方法：(1)設(shè)計(jì)合成4對針對Survivin基因不同位點(diǎn)的miRNA序列,利用轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的片段定向克隆至pcDNATM6.2-GW/Em GFP-miR真核表達(dá)載體上,構(gòu)建靶向survivin基因的miRNA重組質(zhì)粒并進(jìn)行測序鑒定。(2)HT-29細(xì)胞接種于6孔板,空質(zhì)粒與四組重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞中,48小時后熒光倒置顯微鏡觀測各組細(xì)胞熒光情況,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)然后的轉(zhuǎn)染效率,選擇轉(zhuǎn)染效率最高的組為目的基因組。(3)將目的基因組以及空質(zhì)粒組菌株復(fù)蘇,LB培養(yǎng)基培養(yǎng),利用堿變性法提取得到相應(yīng)質(zhì)粒DNA,并對所提取的質(zhì)粒進(jìn)行濃度以及純度的測定。(4)繼續(xù)接種細(xì)胞并將細(xì)胞分為空白對照組、轉(zhuǎn)染試劑組、空質(zhì)粒組(陰性對照組,negtive control,NC)以及目的基因組(陽性對照組,positive control,PC)四組。瞬時轉(zhuǎn)染48小時后收集各組細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的增殖指數(shù)(proliferation index,PI)以及凋亡率(apoptosis rate,AR),實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定各組Survivin mRNA的表達(dá)量,轉(zhuǎn)染72小時后,收集各組細(xì)胞利用免疫印跡法(Western blot)檢測靶基因：Survivin蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：(1)對構(gòu)建的4組pcDNATM6.2-GW/Em GFP-miR真核表達(dá)載體載體進(jìn)行測序,結(jié)果顯示載體構(gòu)建成功。(2)HT-29細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,目的基因組細(xì)胞增殖指數(shù)與其他各組相比有明顯降低(t=20.05, P0.01;t=18.75, P0.01;t=18.59, P0.01),凋亡率明顯增高(t=16.40, P0.01;t=15.84, P0.01;t=15.92, P0.01),正常組、空質(zhì)粒組以及轉(zhuǎn)染試劑組兩兩比較未見明顯差異(P0.05)；靶基因的survivin mRNA表達(dá)明顯降低(t=0.68, P0.01;t=0.58, P0.01;t=0.61, P0.01),蛋白的表達(dá)亦明顯降低(t=0.64, P0.01; t=0.62, P0.01;t=0.67, P0.01),正常組、空質(zhì)粒組以及轉(zhuǎn)染試劑組兩兩比較亦未見明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論：(1)成功構(gòu)建靶向Survivin基因的真核表達(dá)載體pcDNATM6.2-GW/Em GFP-miR。(2)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HT-29細(xì)胞后,可以沉默HT-29細(xì)胞Survivin基因的表達(dá),明顯促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡,并能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。
【關(guān)鍵詞】：真核表達(dá)載體 Survivin miRNA 人結(jié)腸癌細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-8
• 縮略詞表8-10
• 前言10-12
• 1 試驗(yàn)材料12-17
• 2 試驗(yàn)方法17-27
• 3 結(jié)果27-32
• 4 討論32-37
• 5 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 文獻(xiàn)綜述42-52
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 致謝52-53
• 研究生期間發(fā)表論文和參加科研情況說明53

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：977650