本文關(guān)鍵詞：長(zhǎng)鏈非編碼基因HOXD-AS2在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其功能研究

  更多相關(guān)文章： HOXD-AS2 膠質(zhì)瘤 生存分析 預(yù)后 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡 遷移 侵襲

【摘要】：膠質(zhì)瘤(Glioma)是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,其中惡性程度最高的是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma,GBM,WHOⅣ級(jí))。目前膠質(zhì)瘤的治療效果欠佳,GBM患者的中位生存時(shí)間僅僅有1年。盡管手術(shù)切除為主,結(jié)合放療和化療的綜合治療方法得到了廣泛應(yīng)用,GBM病人的預(yù)后結(jié)果仍然難以讓人滿意,絕大多數(shù)患者仍會(huì)在術(shù)后短時(shí)間內(nèi)復(fù)發(fā)。為了提高膠質(zhì)瘤患者的治療效果,在基因和分子水平上探討腫瘤的發(fā)生機(jī)制成為了當(dāng)務(wù)之急。近年來,大量的lncRNAs在人類基因組的轉(zhuǎn)錄本中被發(fā)現(xiàn);并且研究表明其在包括肝癌、胃癌、腎癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等在內(nèi)的多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮有重要的生物調(diào)節(jié)功能;一些lncRNAs的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān);在lnc RNA的研究領(lǐng)域,人們對(duì)其功能及作用機(jī)制尚知之甚少;了解lnc RNA在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的功能及其分子調(diào)節(jié)機(jī)制有助于我們尋找新的膠質(zhì)瘤治療靶點(diǎn)及分子診斷標(biāo)志物。我們利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù),通過檢測(cè)5例正常腦組織樣本和5例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織樣本中基因表達(dá)的差異,初步構(gòu)建了腦膠質(zhì)瘤的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)庫,并通過對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選出在膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)并可能在其發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的lnc RNA。HOXD基因簇反義鏈RNA 2(HOXD-AS2,HOXD cluster antisense RNA 2)即是其中之一。HOXD-AS2定位于人染色體2q31.1,全長(zhǎng)692bp,是Homeobox D基因的反義鏈。芯片數(shù)據(jù)提示其在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)明顯高于正常腦組織。本研究重點(diǎn)對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼基因HOXD-AS2進(jìn)行探索。首先,選取HOXD-AS2基因及另外5條隨機(jī)抽取的基因,利用RT-PCR技術(shù),在用作建立基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)的5例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本和5例正常腦組織標(biāo)本中驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)的可靠性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果同基因芯片的數(shù)據(jù)存在良好的一致性,HOXD-AS2基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)明顯高于正常腦組織。然后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本驗(yàn)證,在45例低級(jí)別膠質(zhì)瘤和57例高級(jí)別膠質(zhì)瘤中檢測(cè)HOXD-AS2基因的表達(dá)量,觀察其表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別及其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性,并分析HOXD-AS2基因的表達(dá)水平與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。最后,利用小干擾RNA技術(shù)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中特異性地干擾HOXD-AS2基因的表達(dá),觀察其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251生長(zhǎng)、增殖、凋亡、侵襲等細(xì)胞惡性表型的影響。第一部分長(zhǎng)鏈非編碼基因HOXD-AS2在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系目的:研究HOXD-AS2基因在正常腦組織、不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平,并分析其與患者臨床預(yù)后的關(guān)系。方法:應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)5例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織標(biāo)本和5例正常腦組織標(biāo)本中HOXD-AS2基因的表達(dá)情況。然后擴(kuò)大樣本量,在8例I級(jí)、37例II級(jí)、24例III級(jí)、33例IV級(jí)膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中檢測(cè)HOXD-AS2基因的表達(dá)量,觀察其與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系;同時(shí)納入患者年齡、性別、腫瘤大小、手術(shù)切除程度等臨床指標(biāo),觀察HOXD-AS2基因的表達(dá)情況(+,++,+++)與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性。并根據(jù)HOXD-AS2基因的表達(dá)情況,將I-IV級(jí)膠質(zhì)瘤中臨床資料完整的共87例患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,隨訪患者生存時(shí)間,通過Kapian-Meier Survival Curve法,觀察HOXD-AS2基因表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系。將I、II級(jí)共40例腫瘤納入低級(jí)別腫瘤組,III、IV級(jí)共47例腫瘤納入高級(jí)別腫瘤組,用同樣的方法分別在低級(jí)別腫瘤組(I+II級(jí))和高級(jí)別腫瘤組(III+IV級(jí))進(jìn)行生存分析,在兩個(gè)亞組內(nèi)進(jìn)一步觀察HOXD-AS2基因表達(dá)水平與患者生存期的關(guān)系。結(jié)果:Real-time PCR結(jié)果提示正常腦組織及I、II、III、IV級(jí)膠質(zhì)瘤中HOXD-AS2/GAPDH的相對(duì)表達(dá)值分別為0.0073±0.0046,0.0519±0.0514,1.3477±2.2276,1.9717±2.9306和1.8884±3.1063,正常腦組織和各級(jí)別腫瘤基因表達(dá)量之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);正常腦組織、低級(jí)別膠質(zhì)瘤(I+II級(jí))和高級(jí)別膠質(zhì)瘤(III+IV級(jí))中HOXD-AS2/GAPDH的相對(duì)表達(dá)值分別為0.00733±0.00460、1.142±2.060和1.924±3.039,正常腦組織和低級(jí)別腫瘤之間、正常腦組織和高級(jí)別腫瘤之間,以及低級(jí)別腫瘤和高級(jí)別腫瘤之間基因表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確概率法觀察HOXD-AS2基因表達(dá)水平與患者年齡、性別、腫瘤大小、手術(shù)切除程度、病理級(jí)別的相關(guān)性發(fā)現(xiàn),HOXD-AS2基因表達(dá)水平僅與腫瘤的病理級(jí)別有關(guān)(p=0.003)。用K-M法和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)HOXD-AS2高表達(dá)組中位總體生存時(shí)間明顯短于HOXD-AS2低表達(dá)組(分別為16個(gè)月和42個(gè)月,p=0.007)。亞組分析發(fā)現(xiàn),這種差異在低級(jí)別膠質(zhì)瘤組(I+II級(jí))更加明顯。結(jié)論:HOXD-AS2基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平較正常腦組織明顯升高,并且其表達(dá)水平與腫瘤的級(jí)別相關(guān),高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤。HOXD-AS2基因高表達(dá)是膠質(zhì)瘤患者,尤其是低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者,預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。第二部分敲減長(zhǎng)鏈非編碼基因HOXD-AS2表達(dá)后對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞功能的影響目的:研究通過小干擾RNA(siRNA)抑制HOXD-AS2表達(dá)后對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞功能的影響。方法:采用siRNA干擾技術(shù),以Lipofectamin3000作為轉(zhuǎn)染載體,在U251細(xì)胞株中特異性地敲減HOXD-AS2的表達(dá),觀察其對(duì)U251細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及遷移、侵襲能力的影響。對(duì)照組分別用U251細(xì)胞+Lipofectamin3000空載體(Mock,M)、U251細(xì)胞+Lipofectamin3000載體+非特異性寡核肽(Negative Control,NC)作為空白對(duì)照(M)、陰性對(duì)照(NC)。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)HOXD-AS2的不同基因位點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成出3條特異性siRNA,以Lipofectamin3000作為轉(zhuǎn)染載體,在U251細(xì)胞株中特異性地敲減HOXD-AS2的表達(dá)。采用Real-time PCR技術(shù)分別在轉(zhuǎn)染后的48hr檢測(cè)HOXD-AS2的表達(dá)水平,從而篩選出干擾效率最高的一條siRNA。用此siRNA作為干擾序列,CCK8法、EDU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況及凋亡情況,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的改變情況。結(jié)果:在干擾U251細(xì)胞中HOXD-AS2表達(dá)后第48小時(shí),CCK8法及EDU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)均提示干擾細(xì)胞株的增殖能力較NC組下降(p0.05);干擾后48小時(shí),經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組U251細(xì)胞株較NC組細(xì)胞周期中處于增殖期(S期+G2期)的細(xì)胞數(shù)目減少(p0.05),細(xì)胞周期發(fā)生阻滯;流式細(xì)胞儀測(cè)凋亡發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞比例未見顯著變化(p0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)提示干擾HOXD-AS2表達(dá)后36小時(shí)和72小時(shí),U251細(xì)胞的遷移能力顯著下降(p0.05);Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力未見顯著變化(p0.05)。結(jié)論:在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251中敲減HOXD-AS2表達(dá)后可使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯,降低細(xì)胞增殖能力,同時(shí)可使細(xì)胞的遷移能力顯著下降,對(duì)細(xì)胞的侵襲能力未見顯著影響。
【關(guān)鍵詞】：HOXD-AS2 膠質(zhì)瘤 生存分析 預(yù)后 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡 遷移 侵襲
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 中英文縮略詞對(duì)照表14-15
• 前言15-17
• 第一部分 長(zhǎng)鏈非編碼基因HOXD-AS2在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后的關(guān)系17-35
• 引言17
• 材料與方法17-24
• 結(jié)果24-32
• 討論32-34
• 小結(jié)34-35
• 第二部分 敲減長(zhǎng)鏈非編碼基因HOXD-AS2表達(dá)后對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞功能的影響35-60
• 引言35
• 材料與方法35-43
• 結(jié)果43-53
• 討論53-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 全文總結(jié)60-61
• 綜述 長(zhǎng)鏈非編碼RNA在腦膠質(zhì)瘤發(fā)病及進(jìn)展中功能作用的研究進(jìn)展61-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 研究生期間科研工作和論文發(fā)表情況68-69
• 致謝69

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本文編號(hào)：967238