本文關(guān)鍵詞：敲低XIST抑制非小細(xì)胞肺癌增殖與轉(zhuǎn)移的研究

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【摘要】：背景與目的:在當(dāng)前環(huán)境下,肺癌已經(jīng)成為世界上最常見且發(fā)病率極高的一類惡性腫瘤,據(jù)統(tǒng)計(jì)肺癌的死亡率高居各類癌癥首位,其中NSCLC在所有的肺癌患者中又占據(jù)了80-85%。NSCLC患者治療總體的5年生存率依然很低,僅僅約16%。新的診斷肺癌的分子生物學(xué)標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn),對(duì)于NSCLC的早期診斷及早期治療尤為重要。在肺癌的發(fā)生與發(fā)展的過(guò)程中一直伴隨非編碼RNA(non-coding RNA)的表達(dá)變化,部分nc RNA已經(jīng)成為NSCLC研究的靶標(biāo)。nc RNA又可以細(xì)分為2種:小的非編碼RNAs(small nc RNAs)與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long nc RNAs)。Lnc RNA表達(dá)具有時(shí)間、空間以及組織等的特異性,它的異常表達(dá)與許多人類疾病包括癌癥有關(guān)。lnc RNA可通過(guò)染色質(zhì)重塑、DNA或組蛋白甲基化而改變基因的表達(dá),還具有吸附mi RNA的海綿等功能。XIST是哺乳動(dòng)物體內(nèi)X染色體失活的主要調(diào)節(jié)基因,XIST在人類細(xì)胞分化、增殖和基因組功能的維護(hù)方面發(fā)揮重要作用。然而,XIST基因不正常表達(dá)可能與癌癥的發(fā)生有關(guān)。盡管有關(guān)lnc RNA XIST的研究已有較多報(bào)道,但是XIST與肺癌是否存在某種調(diào)節(jié)關(guān)系,NSCLC的發(fā)展與XIST基因表達(dá)的調(diào)控關(guān)系仍未見報(bào)道。本研究旨在探討肺癌中XIST基因的表達(dá)改變,以及由XIST基因表達(dá)變化對(duì)NSCLC發(fā)展與轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用。材料與方法:(1)通過(guò)設(shè)計(jì)XIST基因引物和real-time PCR技術(shù)在多種肺癌細(xì)胞中檢測(cè)XIST的表達(dá)情況;(2)應(yīng)用si RNA干擾實(shí)驗(yàn)在A549、NCI-H1299(后面簡(jiǎn)稱H1299)細(xì)胞將XIST敲低,劃痕實(shí)驗(yàn)探究XIST敲低后細(xì)胞的遷移能力改變,transwell實(shí)驗(yàn)用于探究XIST被敲低后肺癌細(xì)胞的侵襲能力改變,使用熒光實(shí)驗(yàn)再次對(duì)XIST敲低后的癌細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行驗(yàn)證;(3)構(gòu)建XIST被敲低的慢病毒,慢病毒感染癌細(xì)胞A549與H1299,并篩選得到穩(wěn)定敲低XIST的肺癌細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)與CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)XIST被敲低后細(xì)胞的增殖能力及凋亡情況變化,平板克隆實(shí)驗(yàn)也可用于探究XIST基因?qū)?xì)胞增殖的影響;(4)異種移植瘤模型實(shí)驗(yàn),在體內(nèi)驗(yàn)證XIST被敲低后,腫瘤的增殖能力是否與細(xì)胞水平一致。(5)western blot實(shí)驗(yàn)探究XIST調(diào)節(jié)肺癌生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路或者蛋白,確定XIST的作用靶點(diǎn);(6)通過(guò)生物信息學(xué)分析軟件,發(fā)現(xiàn)XIST基因與mi R-449a存在可能相互作用的靶點(diǎn),設(shè)計(jì)XIST基因定點(diǎn)突變,采用real-time PCR技術(shù)和luciferase熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)信息學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:(1)Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與正常的人支氣管細(xì)胞相比,所選取肺癌細(xì)胞系中XIST基因均出現(xiàn)了不同程度的表達(dá)升高,在轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的H1299細(xì)胞中XIST的表達(dá)高于轉(zhuǎn)移能力弱的H460細(xì)胞;(2)采用si RNA能夠成功敲低XIST基因并且在A549及H1299細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。在A549及H1299細(xì)胞內(nèi)XIST基因被敲低后,劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞系的劃痕愈合能力出現(xiàn)不同程度的降低。transwell實(shí)驗(yàn)分別對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力及侵襲能力進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)在XIST被敲低后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力出現(xiàn)下降,同時(shí)細(xì)胞的侵襲能力也降低。通過(guò)熒光實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的侵襲能力驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),XIST敲低后細(xì)胞的侵襲能力降低;(3)采用慢病毒感染,篩選出XIST基因穩(wěn)定低表達(dá)的A549與H1299細(xì)胞株,流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果表明當(dāng)XIST被敲低后,A549與H1299細(xì)胞的凋亡率增加,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XIST敲低后的細(xì)胞增殖能力顯著降低,平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示陰性對(duì)照組細(xì)胞的增殖數(shù)遠(yuǎn)多于實(shí)驗(yàn)組。細(xì)胞非貼壁生長(zhǎng)能力檢測(cè)結(jié)果顯示XIST敲低后H1299與A549細(xì)胞球的數(shù)量低于陰性對(duì)照組。(4)裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn),采用穩(wěn)定低表達(dá)XIST的A549細(xì)胞在小鼠體內(nèi)成瘤的能力低于陰性對(duì)照組。(5)western blot結(jié)果顯示當(dāng)XIST被敲低后,與凋亡及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白均出現(xiàn)不同程度的表達(dá)變化。(6)Luciferase實(shí)驗(yàn)表明在XIST定點(diǎn)突變后,mi R-449a過(guò)表達(dá)時(shí)熒光增強(qiáng),當(dāng)野生型XIST基因存在時(shí)過(guò)表達(dá)mi R-449a熒光減弱,當(dāng)野生型XIST基因與mi R-NC同時(shí)存在時(shí),熒光增強(qiáng)。結(jié)論:(1)XIST基因在NSCLC細(xì)胞系表達(dá)增加,促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖,抑制肺癌細(xì)胞的凋亡。(2)敲低XIST時(shí)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲被抑制,表明XIST可能具有促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移與侵襲的能力。(3)XIST基因可能通過(guò)下調(diào)mi R-449a基因,從而使Bcl-2蛋白表達(dá)增加抑制肺癌細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：非小細(xì)胞肺癌 長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIST 增殖 凋亡 轉(zhuǎn)移
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語(yǔ)/符號(hào)說(shuō)明10-11
• 前言11-15
• 研究現(xiàn)狀、成果11-12
• 研究目的、方法12-15
• 一、XIST被敲低可抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展15-46
• 1.1 對(duì)象和方法15-29
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料15-18
• 1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)18-19
• 1.1.3 RNA提取19-22
• 1.1.4 細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)22-29
• 1.2 結(jié)果29-41
• 1.2.1 長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIST基因在肺癌細(xì)胞中表達(dá)增加29-31
• 1.2.2 當(dāng)XIST基因表達(dá)降低后，，NSCLC細(xì)胞的增殖能力降低31-32
• 1.2.3 敲低XIST后NSCLC細(xì)胞凋亡率增加32
• 1.2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)敲低XIST后NSCLC細(xì)胞增殖能力降低32-34
• 1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)與transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明干擾XIST基因后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力降低34-36
• 1.2.6 當(dāng)XIST基因被干擾后NSCLC細(xì)胞的侵襲能力明顯降低36-37
• 1.2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)XIST基因被干擾后NSCLC的生長(zhǎng)被抑制37-41
• 1.3 討論41-44
• 1.4 小結(jié)44-46
• 二、XIST通過(guò)抑制miR-449a基因而上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)46-58
• 2.1 對(duì)象和方法46-52
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料46-48
• 2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)48-49
• 2.1.3 Luciferase及western blot實(shí)驗(yàn)49-52
• 2.2 結(jié)果52-56
• 2.2.1 長(zhǎng)鏈非編碼RNA XIST基因與miR-449a相互抑制52-53
• 2.2.2 Luciferase結(jié)果表明XIST基因與miR-449a可能作用關(guān)系53-54
• 2.2.3 Western blot結(jié)果研究與XIST功能相關(guān)蛋白的變化54-56
• 2.3 討論56-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-63
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明63-64
• 綜述 腫瘤細(xì)胞代謝與腫瘤轉(zhuǎn)移相互關(guān)系的研究進(jìn)展64-76
• 綜述參考文獻(xiàn)71-76
• 致謝76-77
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷77

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本文編號(hào)：963511