本文關(guān)鍵詞：肝螺桿菌對肝癌細胞侵襲能力的影響及分子機制的初步研究

  更多相關(guān)文章： 肝螺桿菌 肝癌 侵襲 Toll受體4

【摘要】：背景及目的原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是由肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞發(fā)生的惡性腫瘤,人類最常見的惡性腫瘤之一,而我國是肝癌的高發(fā)國,其中45%發(fā)生在我國,是我國一種常見的惡性腫瘤,在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中排第三位,僅次于胃癌和食管癌。我國是世界上肝癌發(fā)生率和死亡率最高的國家,嚴重威脅著廣大患者的健康。流行病學(xué)調(diào)查研究顯示,隨著人們生活環(huán)境的不斷變化,在全世界范圍內(nèi),肝癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,目前全世界每年新增50萬～100萬病例,本病多發(fā)于中年男性,男女之比為2-5：1。肝癌的發(fā)病與治療一直是當今醫(yī)學(xué)界研究的熱點,隨著大量的臨床實驗及基礎(chǔ)試驗的深入研究,肝癌在診斷及治療方面取的重大的進展,但相當多的肝癌發(fā)現(xiàn)時已是晚期,目前其臨床治療效果還相當有限。全世界肝癌患者5年生存率不到15%,死亡率為20.73/10萬,全球平均每年約有25萬人死于肝癌。即使是接受根治手術(shù)的病人術(shù)后5年內(nèi),復(fù)發(fā)率仍有30%至40%。目前,肝癌的治療以外科手術(shù)為主,治療肝癌最直接、最有效的手段仍然是肝臟腫瘤切除和肝移植術(shù),輔以放療、化療以及其他輔助治療的綜合治療手段雖然不斷取得進展,但總體治療效果仍不理想,復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是影響肝癌預(yù)后的最主要原因。積極尋找肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素,闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機制仍是肝臟腫瘤防治研究的重點和難點。腫瘤的轉(zhuǎn)移與其癌細胞的侵襲能力密切相關(guān),我們可通過抑制癌細胞的侵襲來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。相反,如果人體長期暴露于一種促進細胞侵襲能力的環(huán)境中,發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性就會更高。目前普遍認為肝癌是多因素作用,多基因參與,多階段發(fā)展的疾病,然而其發(fā)生和發(fā)展的確切機制仍未闡明。我國科研工作者對肝癌進行了長期研究發(fā)現(xiàn),在我國肝癌高發(fā)區(qū)存在著數(shù)十種與肝癌發(fā)生有關(guān)的因素,其中最主要的原因是乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染,肝硬化、黃曲霉素、飲水污染、遺傳因素也與肝癌的發(fā)病密切相關(guān),此外,某些其他物質(zhì)如亞硝胺類、偶氮芥類、酒精、微量元素及寄生蟲感染均是可疑的致肝癌物質(zhì)。大量流行病學(xué)調(diào)查及基礎(chǔ)實驗證據(jù)表明,慢性感染與某些嚴重疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括癌癥。9種傳染性病原體已被證實為人類致癌物,每年全世界新增癌癥病例中17%由感染所致,尤其是的發(fā)展中國家,可以達到26%,而在發(fā)達國家所占比例相對較少,為7.2%左右。炎癥是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要組成部份。許多癌癥產(chǎn)生于慢性感染和炎癥部位。慢性炎癥所形成的腫瘤微環(huán)境為腫瘤的發(fā)生和生長提供了條件,是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移不可缺少的參與者。鼻咽癌、胃癌、肝癌、宮頸癌等均是與感染相關(guān)且發(fā)病率較高的惡性腫瘤,尤其胃癌及肝癌居我國消化系統(tǒng)惡性腫瘤的前3位,因此重視感染因素在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的作用,對于開發(fā)惡性腫瘤新的診療措施具有重要意義。在這些與腫瘤相關(guān)的感染因素中,最主要的是病毒感染,寄生蟲和細菌也占一定比例。自1982年Warren等成功分離幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)以來,Hp感染已被國內(nèi)外很多學(xué)者所研究,Hp被認為是世界上感染率最高的細菌之一,其作為慢性胃炎及消化性潰瘍主要病因已被許多研究肯定及確認,Hp感染與胃癌的發(fā)生也密切相關(guān),并于1994年被列為第1類致癌因子,人類首次將細菌感染與癌癥的發(fā)生聯(lián)系在一起。此后,隨著對螺桿菌屬研究的深入,越來越多的螺桿菌屬細菌被鑒定和分離出,迄今已發(fā)現(xiàn)20多種。根據(jù)定居部位不同,螺桿菌分為胃螺桿菌和腸肝螺桿菌。肝螺桿菌作為腸肝螺桿菌中的一員,屬于與肝臟疾病有明確關(guān)系的五種肝螺桿菌(幼禽螺桿菌、肝螺桿菌、膽汁螺桿菌、膽囊螺桿菌、犬螺桿菌)之一。1992年,美國國家癌癥研究所的Frederick癌癥研究發(fā)展中心,發(fā)現(xiàn)在一項長期的毒理學(xué)研究中,作為對照組并無菌飼養(yǎng)的A/JCr小鼠發(fā)生原因不明的肝炎和肝臟腫瘤。排除化學(xué)及其他致癌因素后,在小鼠肝臟組織中檢出一種螺旋狀細菌,后經(jīng)電鏡掃描、生化性狀鑒定及基因測序證實是一種與Hp有關(guān)的新品種螺桿菌,因其與動物肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),1994年正式命名為肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus,H.hepaticus,Hh)。多項研究表明,Hh可長期定植于嚙齒動物的肝臟,引起慢性肝炎、肝癌等病變。Hh主要定植于下消化道,包括盲腸、結(jié)腸以及肝膽管系統(tǒng),目前沒在胃內(nèi)找到。該菌的自然宿主是鼠類,但在人類肝臟組織中也有檢出的報道。國內(nèi)外許多學(xué)者利用PCR、DNA序列分析、免疫組化證實了人肝癌組織中確實存在螺桿菌感染,這充分說明螺桿菌能夠在人類肝組織中生存。Hh因其誘導(dǎo)引起的肝臟損害的病理特征與人類慢性肝病在許多方面相似,使Hh感染相關(guān)疾病的研究成為研究的熱點。原發(fā)性肝癌的病因及確切分子機制尚不完全清楚,目前認為其發(fā)病是多因素、多步驟的復(fù)雜過程,且受環(huán)境和遺傳雙重因素影響。自Hp發(fā)現(xiàn)以來,許多新螺桿菌屬成員陸續(xù)從動物及禽類等體內(nèi)分離到。其中有的對人或動物有明確的致病性,有的致病性尚不明確或有潛在的致病性。眾所周知,Hp感染與胃癌的發(fā)生展密切相關(guān),后來也在貓類動物中分離出了Hp,由此促使我們思考肝癌的發(fā)生發(fā)展是否也與螺桿菌感染有關(guān)。大量研究表明人們多次通過動物實驗證實Hh感染能導(dǎo)致某些品系小鼠肝癌的發(fā)生,Hh感染是否也可能在人肝癌的發(fā)生中起一定作用?Hh可能作為原發(fā)性肝癌的一個獨立致病因素或者輔助因素,但有待更多有力的實驗證據(jù)支持。近年來關(guān)注Hh致病機制的學(xué)者也在增多,但研究實驗大多停留在動物和組織水平,關(guān)于Hh直接作用于細胞的報道還是寥寥無幾,因此,在離體條件下,研究Hh能否作用肝癌細胞,這將有助于進一步認識Hh感染與肝癌發(fā)生發(fā)展機制的關(guān)系。新近研究發(fā)現(xiàn),Toll樣受體(Toll like receptor,TL R)能結(jié)合機體自身產(chǎn)生的一些內(nèi)源性分子(即內(nèi)源性配體),由于腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中可以產(chǎn)生一些能被TLRs識別的內(nèi)源性配體,所以TLRs在腫瘤免疫監(jiān)視中可能發(fā)揮了一定作用。而TLR4作為TLRs家族中的一員,被證實在肝癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌及肺癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達,其基因及蛋白表達水平與腫瘤的惡性程度明顯相關(guān)。TLR4的功能性表達可能在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的作用。很多研究表明TLR4能夠促進腫瘤發(fā)生發(fā)展,TLR4的mRNA和蛋白表達水平在肝癌組織及細胞中都有增高,且TLR4的表達水平與肝癌的惡性程度呈正相關(guān)。研究認為,螺桿菌可通過直接激活TLR4而觸發(fā)炎癥反應(yīng),而炎癥反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但是,Hh是否可促進肝癌細胞的侵襲能力還不甚清楚,其相關(guān)的機制如何還有待我們進一步探究。本研究旨在闡述Hh對腫瘤細胞本身的直接作用,研究Hh活菌對肝癌細胞侵襲能力的影響及其可能機制。因此,本課題以Hh為研究因素,以人肝癌細胞株HEPG2和HCCLM3作為研究對象,采用Transwell侵襲實驗、Western-blot、RealtimePCR及siRNA干擾方法分析Hh活菌對肝癌細胞侵襲能力的影響以及其相關(guān)因子基因及蛋白水平表達差異,探討其可能分子機制。研究方法(1)Hh對人肝癌細胞侵襲能力的影響：①分別以不同濃度的Hh活菌作用于肝癌細胞HEPG2和HCCLM3,分為以下兩組,實驗組為不同濃度Hh活菌(1×109CFU/ml、1×108CFU/ml、1×107CFU/ml、1x106CFU/ml)作用組,每組分別觀察12h、24h、48h、72h；另以僅加入無Hh空白液體培養(yǎng)基為對照組。②通過Transwell實驗,檢測各組細胞不同時間點侵襲細胞數(shù)量,以此觀察濃度不同、時間不同情況下Hh對肝癌細胞的侵襲能力的影響。并依此為根據(jù),確定后續(xù)實驗Hh的最佳刺激濃度及刺激時間。(2)Hh誘導(dǎo)人肝癌細胞產(chǎn)生IL-8、TGF-β1、 MMP-2和MMP-9的研究：①以第一部分確定的Hh活菌最佳刺激濃度及最佳刺激時間,Hh與肝癌細胞共孵育為實驗組,無Hh空白液體培養(yǎng)基為對照組。②利用ELISA方法,檢測各組細胞所分泌的IL-8和TGF-β1的濃度變化。③采用Western Blot方法,檢測各組細胞內(nèi)MMP-2和MMP-9蛋白的表達水平,④通過realtime PCR實驗方法檢測各組細胞IL-8、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA的表達。(3)Hh通過影響TLR4/MyD88信號通路增強人肝癌細胞侵襲能力：①用Western Blot檢測各組細胞中TLR4、MyD88、TRIF蛋白的表達；②利用real time PCR在mRNA水平對各組細胞TLR4、MyD88、TRIF的表達進行驗證；③建立siRNA干擾系統(tǒng),下調(diào)HEPG2和HCCLM3細胞中TLR4和MyD88基因的表達,使用Western Blot檢測TLR4、MyD88表達水平,驗證siRNA干擾的效果。分別設(shè)置TLR4 siRNA、MyD88 siRNA干擾組、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無關(guān)序列)和空白對照組(空白轉(zhuǎn)染),用Hh作用為各組細胞,通過Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力是否有變化。研究結(jié)果(1)Hh對人肝癌細胞侵襲能力的影響：①實驗組細胞的侵襲能力明顯高于對照組(P0.05),并且在一定范圍內(nèi)隨著Hh刺激濃度的增加,肝癌細胞侵襲能力增加,同時間段內(nèi),刺激濃度為1×108CFU/ml時侵襲能力到達峰值。②在各濃度組中,在一定范圍內(nèi),隨著Hh活菌作用時間的延長,Hh對肝癌細胞侵襲能力的作用增加,同濃度時,刺激時間為48h侵襲能力達到峰值。(2)Hh誘導(dǎo)人肝癌細胞產(chǎn)生IL-8、TGF-β1、 MMP-2和MMP-9的研究：經(jīng)Hh活菌刺激后,實驗組分泌IL-8和TGF-β1的水平明顯高于對照組(P0.05),HEPG2和HCCLM3細胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平也顯著提高,mRNA水平也證明了相似的結(jié)果(P0.05)。(3)Hh通過影響TLR4/MyD88信號通路增強人肝癌細胞侵襲能力：①實驗組中,HEPG2和HCCLM3細胞中TLR4、MyD88蛋白水平明顯高于對照組(P0.05),TRIF的表達水平與對照組沒明顯差異(P0.05)。mRNA水平也證明了相似的結(jié)果。②siRNA干擾系統(tǒng)可以成功實現(xiàn)對HEPG2和HCCLM3細胞中TLR4或MyD88分子表達的干擾。Western Blot實驗結(jié)果顯示,在人肝癌細胞轉(zhuǎn)染siRNA后幾乎不表達TLR4或MyD88。Hh活菌作用于各組細胞后,Transwell實驗顯示,與正常對照組相比,Hh不能增加實驗組細胞的侵襲能力,此時這些肝癌細胞的侵襲能力下降。研究結(jié)論(1)Hh活菌能以時間和濃度依賴的方式增加肝癌細胞HEPG2和HCCLM3細胞的侵襲能力。(2)Hh誘導(dǎo)肝癌細胞分泌IL-8、TGF-β1及表達MMP-2和MMP-9,這些升高的細胞因子以及蛋白均可以幫助肝癌細胞消化人工基質(zhì)膜,從而促進肝癌細胞的侵襲能力。這可能是Hh增強肝癌細胞的侵襲能力的機制之一(3)Hh活菌可以上調(diào)肝癌細胞株HEPG2和HCCLM3中TLR4及其下游分子MyD88蛋白及mRNA的表達水平,但不影響TRIF的表達,說明Hh活菌可能特異激活肝癌細胞內(nèi)TLR4/MyD88信號通路。(4)Hh活菌不能增加不表達TLR4或MyD88的肝癌細胞侵襲能力,此時肝癌細胞的侵襲能力下降明顯。這表明,Hh活菌增強人肝癌細胞的侵襲能力是通過TLR4/MyD88信號通路介導(dǎo)的,TLR4/MyD88對肝癌細胞的侵襲能力也十分關(guān)鍵。
【關(guān)鍵詞】：肝螺桿菌 肝癌 侵襲 Toll受體4
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-23
• 第二章 肝螺桿菌對人肝癌細胞侵襲能力的影響23-45
• 2.1 材料與方法23-37
• 2.2 結(jié)果37-40
• 2.3 討論40-44
• 2.4 結(jié)論44-45
• 第三章 肝螺桿菌通過影響TLR4/MyD88信號通路增強人肝癌細胞侵襲能力45-60
• 3.1 材料與方法45-54
• 3.2 結(jié)果54-57
• 3.3 討論57-59
• 3.4 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-64
• 附錄64-65
• 攻讀學(xué)位期間成果65-66
• 致謝66-67

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳伯文,潘澤亞,吳孟超;晚期肝癌的多模式綜合治療[J];中國實用外科雜志;2000年10期

2 方晉平,高玫;“多彈頭”射頻治療肝癌[J];國外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊);2001年06期

3 唐艷,章榮華,樓曉明,孟佳;飲酒、吸煙與肝癌關(guān)系的調(diào)查[J];浙江預(yù)防醫(yī)學(xué);2001年12期

4 孫俊芳,王曹軍;肝癌超聲診斷若干問題探討[J];職業(yè)與健康;2001年10期

5 田俊 ,孫昌盛;同安肝癌生存時間分布的統(tǒng)計模型研究[J];中國衛(wèi)生統(tǒng)計;2002年01期

6 郭雅,彭民浩,黎樂群;晚期肝癌綜合治療研究進展[J];臨床外科雜志;2002年05期

7 陸東東;肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)及其綜合治療研究進展[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2002年03期

8 趙飛;全埋入式藥物輸注裝置治療中晚期肝癌5例體會[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2002年09期

9 徐峰,楊甲梅,嚴以群,劉鵬飛,溫增慶,吳孟超;肝癌肝切除術(shù)后并發(fā)癥的處理(附592例報告)[J];中華肝膽外科雜志;2002年07期

10 吳孟超,陳漢,沈鋒,程樹群;微創(chuàng)在肝癌外科治療中的地位[J];中國微創(chuàng)外科雜志;2002年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 羅偉玲;陳澤紅;;在肝癌病人中開展健康教育的幾點體會[A];全國護理臨床研究學(xué)術(shù)交流暨專題講座會議論文會編[C];2001年

2 湯釗猷;;提高肝癌療效的探討[A];2008年浙江省外科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

3 鄭樹森;;肝癌的診治進展[A];2009年浙江省外科學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

4 曾文鋌;謝青山;朱科倫;馬佩球;劉衍民;;射頻毀損治療中晚期肝癌的初步研究(附12例臨床報告)[A];2000全國腫瘤學(xué)術(shù)大會論文集[C];2000年

5 宋恕平;盛立軍;劉波;;肝癌藥物治療的新探索[A];中國臨床腫瘤學(xué)教育專輯（2001）——中國抗癌協(xié)會臨床腫瘤學(xué)協(xié)作中心（CSCO）第五屆年會論文集[C];2001年

6 陸益錢;;肝癌病人的健康教育體會[A];第一屆全國腫瘤護理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2001年

7 楊秉輝;;肝癌綜合治療的選擇[A];第三屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會教育論文集[C];2004年

8 談菊萍;;肝癌病人的心理表現(xiàn)及護理對策[A];全國腫瘤護理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2005年

9 曾帶娣;岳建榮;王翠霞;田月月;;肝癌病人心理變化的護理對策[A];全國傳染病護理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2006年

10 林云萍;;肝癌病人的心理特點及護理對策[A];全國腫瘤護理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2008年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 黃才剛;肝癌宜因人施治[N];健康報;2000年

2 鐘肖協(xié);肝癌“偏愛”哪些人[N];陜西日報;2000年

3 黃顯斌邋唐明山;我科學(xué)家在肝癌發(fā)病機制研究中取得重大進展[N];光明日報;2007年

4 福星;肝癌如何早發(fā)現(xiàn)[N];民族醫(yī)藥報;2007年

5 張蜀梅　張啟 柳海山;病從口入,穗年增逾3000肝癌患者[N];南方日報;2007年

6 記者 于麗珊邋通訊員 黃顯斌;肝癌發(fā)病機制研究獲進展[N];中國中醫(yī)藥報;2007年

7 王振坤;乙肝與肝癌[N];家庭醫(yī)生報;2007年

8 李荔;周鋼橋：易得肝癌的基因[N];北京科技報;2010年

9 本報記者 白軼南 通訊員 黃顯斌;早診斷早手術(shù) 肝癌患者生命延續(xù)之關(guān)鍵[N];保健時報;2005年

10 特約撰稿 北京解放軍302醫(yī)院 黃顯斌 特約專家 北京解放軍302醫(yī)院感染內(nèi)科副主任、副主任醫(yī)師 馮永毅;遠離肝癌 病因預(yù)防是關(guān)鍵[N];家庭醫(yī)生報;2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 牟培源;超聲引導(dǎo)超抗原瘤區(qū)注射協(xié)同微波治療肝癌后局部免疫應(yīng)答與預(yù)后關(guān)系的臨床研究[D];軍醫(yī)進修學(xué)院;2001年

2 岳攀;脫-γ-羧基凝血酶原促進肝癌增殖與轉(zhuǎn)移機制研究[D];山東大學(xué);2011年

3 黃燕;肝癌患者肝組織中螺桿菌感染的研究[D];中南大學(xué);2003年

4 宋培明;氨基酸同位素標記技術(shù)在肝癌疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用[D];上海交通大學(xué);2009年

5 洪德飛;半導(dǎo)體散射激光局部熱療消融肝癌的實驗研究[D];浙江大學(xué);2002年

6 張百紅;多因素Cox回歸分析構(gòu)建肝癌分期系統(tǒng)[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

7 羅小玲;樹突狀細胞介導(dǎo)肝癌免疫治療的實驗與臨床研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2006年

8 周蓓;參桃軟肝方對中晚期肝癌保肝抑瘤的臨床及實驗研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2009年

9 惠利健;對肝癌基因表達譜和腫瘤相關(guān)剪接類型的分析[D];中國科學(xué)院研究生院（上海生命科學(xué)研究院）;2003年

10 張帥;新的抑癌microRNA miR-520e的發(fā)現(xiàn)及其在肝癌中作用分子機制的研究[D];南開大學(xué);2012年

，

本文編號：963129