本文關(guān)鍵詞：MiRNA-451調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤細胞葡萄糖能量代謝和生物學(xué)行為的機制研究

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【摘要】：惡性膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性顱腦腫瘤,中位生存期約14個月,其具有易復(fù)發(fā),無限增殖和侵襲性生長的特點,給臨床治療增加很大難度,傳統(tǒng)神經(jīng)外科手術(shù)和放化療方法仍然難以完全治愈惡性膠質(zhì)瘤。惡性膠質(zhì)瘤是一種多基因異常表達的腫瘤,包括原癌基因的異常過表達和抑癌基因的缺失或突變,導(dǎo)致腫瘤細胞逃避了正常生長機制的調(diào)控。隨著近幾年基因和分子生物學(xué)的快速發(fā)展,探索膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展的分子機制和尋找新的治療手段成為國內(nèi)外領(lǐng)域研究重點方向。miRNA是一類長度大約為19-25個核苷酸序列的非編碼RNAs,能夠與靶基因的3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域部分或者全部特異性結(jié)合,從而降解靶mRNA或者抑制其蛋白質(zhì)的翻譯過程,從而實現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄后進行調(diào)控。到目前為止,在人類組織和細胞中發(fā)現(xiàn)了上千種miRNAs,并且約三分之一的蛋白質(zhì)編碼基因通過miRNA調(diào)控,具有高度的時空和組織特異性。同一miRNA可以同時靶向調(diào)控多個mRNA基因,并且一個靶向mRNA基因也可以同時被多個不同的miRNA分子調(diào)控,故miRNA的作用方式被稱之為“一對多或者多對一”。與靶基因相互作用,它們不僅參與了細胞和組織生長發(fā)育,新陳代謝,新生血管形成,而且介導(dǎo)細胞增殖、侵襲和凋亡等生物學(xué)過程,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的能量代謝方面起著重要的調(diào)控作用。因此,它將為腫瘤研究領(lǐng)域包括腫瘤標志物和腫瘤的靶向治療等方面提供新的研究方向。大量研究證明miRNA-451位于染色體17q11.2位置,與HER2的17q11.2-21區(qū)域相毗鄰,在很多惡性腫瘤中異常表達,尤其在惡性膠質(zhì)瘤干細胞中表達量顯著降低。Godlewski等研究認為miRNA-451能抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移,并通過RT-PCR方法證明了發(fā)生遷移的膠質(zhì)瘤細胞中的miRNA-451表達出現(xiàn)了降低。Godlewski等還提出了miRNA-451在某種條件下能夠控制能量代謝的開關(guān),使腫瘤細胞在惡劣的代謝環(huán)境壓下仍能夠發(fā)生適應(yīng)性的改變。Kim Y等研究證明在惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲過程中miRNA-451與AMPK之間存在相互拮抗的作用,miRNA-451的過表達或者CAB39/AMPK信號通路受到阻斷都能明顯抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞的侵襲能力。David Carling等認為AMPK是一種天然的能量感受器,介導(dǎo)真核生物的能量平衡。Christine K等認為抑制PI3K/AKT通路能夠阻止腫瘤細胞糖酵解代謝葡萄糖提供能量。Warburg等認為腫瘤細胞不管在有氧還是無氧條件下都通過糖酵解反應(yīng)消耗葡萄糖提供能量(ATP)。而葡萄糖進入腫瘤細胞內(nèi)進行能量代謝須依賴于細胞膜上的蛋白載體(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白,GLUT)進行轉(zhuǎn)運。且GLUT1是哺乳動物中表達最為廣泛的轉(zhuǎn)運體,尤其在腦實質(zhì)細胞中更為常見。而GLUT1作為GLUTs家族中的典型代表,在很多腫瘤中明顯高表達,尤其在惡性膠質(zhì)瘤當中表達量明顯增高。本課題組前期研究已經(jīng)闡述了miRNA-451能夠抑制了惡性膠質(zhì)瘤細胞的生長,但是具體的作用機制尚不清楚。因此本次研究目的是探索miRNA-451基因?qū)盒阅z質(zhì)瘤細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運的調(diào)控作用,進而影響其葡萄糖能量代謝效率,最終對惡性膠質(zhì)瘤細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。本課題將從以下兩個方面進行研究:第一方面:miRNA-451對人腦惡性膠質(zhì)瘤細胞系的葡萄糖能量代謝影響機制的研究。常規(guī)培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細胞系LN229和U87兩種細胞系,并用慢病毒載體攜帶寡核苷酸miRNA-451和miRNA-NC進行轉(zhuǎn)染。實驗分為空白對照組(Blank control)、慢病毒miRNA陰性對照組(Lentivirus miRNA negative control,LV-miRNA-NC)和Lentivirus miRNA-451組(簡稱LV-miRNA-451);實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實驗證明惡性膠質(zhì)瘤細胞系各組細胞中的miRNA-451轉(zhuǎn)染后的表達水平,并驗證各組細胞中的GLUT1 mRNA的表達水平;細胞免疫熒光和Western Blot實驗驗證GLUT1蛋白在各組細胞中的表達水平;STRING計算機軟件以及前期研究成果構(gòu)建miRNA-451調(diào)控GLUT1基因的信號通路;Western Blot實驗進一步驗證miRNA-451調(diào)控GLUT1基因信號通路中相關(guān)目的蛋白的表達量;多功能酶標儀分析各組細胞的葡萄糖攝取量、乳酸產(chǎn)生量以及ATP產(chǎn)生量。結(jié)果顯示:與Blank control組和LV-miRNA-NC組相比,RT-PCR研究結(jié)果表明LV-miRNA-451組的miRNA-451基因表達量明顯上調(diào),并且GLUT1 mRNA的表達水平明顯降低;細胞免疫熒光和Western Blot實驗證明LV-miRNA-451組的GLUT1蛋白表達量明顯降低;信號通路圖顯示miRNA-451靶標CAB39通過LKB1/AMPK和PI3K/Akt兩條通路調(diào)控GLUT1基因表達;Western blot實驗結(jié)果證明LV-miRNA-451組miRNA-451調(diào)控GLUT1基因信號通路中相關(guān)目的蛋白CAB39、LKB1、AMPK、PI3K、Akt以及GLUT1蛋白表達量都顯著降低;多功能酶標儀檢測結(jié)果證明LV-miRNA-451組的細胞內(nèi)葡萄糖攝取量顯著減少,乳酸產(chǎn)生量明顯減少以及ATP產(chǎn)物明顯減少,差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第二方面:miRNA-451對人腦惡性膠質(zhì)瘤細胞系生物學(xué)行為影響的研究。按照上述方法轉(zhuǎn)染并分組,定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實驗證明惡性膠質(zhì)瘤細胞系各組細胞中的miRNA-451轉(zhuǎn)染后的表達水平;CCK-8法和細胞平板克隆形成實驗檢測膠質(zhì)瘤細胞系各組細胞增殖活性能力;Transwell實驗驗證膠質(zhì)瘤細胞系各組細胞侵襲能力;細胞劃痕實驗檢測膠質(zhì)瘤細胞系各組細胞遷移能力;Western blot實驗檢測惡性膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)行為相關(guān)目的蛋白表達量。結(jié)果顯示:與Blank control和LV-miRNA-NC組相比,RT-PCR實驗證明LV-miRNA-451組的miRNA-451表達量明顯上調(diào);CCK-8法和細胞平板克隆實驗表明LV-miRNA-451組的細胞增殖活性能力顯著減弱;Transwell實驗結(jié)果證明LV-miRNA-451組細胞侵襲能力明顯減弱;細胞劃痕實驗結(jié)果顯示LV-miRNA-451組細胞遷移能力明顯受到抑制;Western blot實驗結(jié)果顯示LV-miRNA-451組惡性膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)行為相關(guān)的目的蛋白Cyclin D1、MMP-2、MMP-9、PCNA以及E-Cadherin蛋白表達量明顯降低,差異都具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:miRNA-451靶向CAB39通過LKB1/AMPK和PI3K/Akt兩條通路明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞系中的GLUT1基因表達,降低了其葡萄糖轉(zhuǎn)運率降低,從而導(dǎo)致惡性膠質(zhì)瘤細胞葡萄糖攝取量和能量產(chǎn)生量降低;最終導(dǎo)致miRNA-451明顯抑制了惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力。
【關(guān)鍵詞】：惡性膠質(zhì)瘤 miRNA-451 GLUT1 葡萄糖代謝 增殖 侵襲 遷移
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 縮略語/符號說明13-14
• 前言14-17
• 研究現(xiàn)狀、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 一、MiRNA-451調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤細胞葡萄糖能量代謝的研究17-51
• 1.1 引言17-18
• 1.2 材料和方法18-29
• 1.2.1 材料18-21
• 1.2.2 方法21-29
• 1.3 結(jié)果29-47
• 1.3.1 RT-PCR檢測miRNA-451以及GLUT1基因的表達水平29-36
• 1.3.2 細胞免疫熒光實驗檢測GLUT1蛋白表達水平36-38
• 1.3.3 Western blot實驗檢測GLUT1蛋白表達水平38-40
• 1.3.4 構(gòu)建并驗證miRNA-451調(diào)控GLUT1基因的信號通路40-43
• 1.3.5 miRNA-451抑制葡萄糖攝取能力、乳酸產(chǎn)生能力和ATP產(chǎn)生能力43-47
• 1.4 討論47-50
• 1.5 小結(jié)50-51
• 二、MiRNA-451調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)行為的研究51-73
• 2.1 引言51
• 2.2 材料和方法51-54
• 2.2.1 材料51-52
• 2.2.2 方法52-54
• 2.3 結(jié)果54-68
• 2.3.1 Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后惡性膠質(zhì)瘤細胞中miRNA-451的表達水平54-55
• 2.3.2 CCK-8 法檢測惡性膠質(zhì)瘤細胞增殖能力55-57
• 2.3.3 平板克隆實驗檢測惡性膠質(zhì)瘤細胞克隆形成能力57-59
• 2.3.4 Transwell實驗檢測惡性膠質(zhì)瘤細胞侵襲能力59-62
• 2.3.5 細胞劃痕實驗檢測惡性膠質(zhì)瘤細胞遷移能力62-66
• 2.3.6 Western blot檢測惡性膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)行為相關(guān)目的蛋白表達66-68
• 2.4 討論68-72
• 2.5 小結(jié)72-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻74-82
• 發(fā)表論文與參與科研情況說明82-83
• 綜述 MiRNAs與GLUT1在腫瘤能量代謝中的研究進展83-94
• 綜述參考文獻89-94
• 致謝94-96
• 個人簡歷96

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2 郭德玉,陳意生,卞修武,辛榕;去甲二氫愈創(chuàng)木酸對惡性膠質(zhì)瘤細胞周期的影響[J];腫瘤防治研究;2000年01期

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2 韓磊;岳曉;張安玲;楊e，

本文編號：962342