本文關(guān)鍵詞：血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞氧化磷酸化活性的影響及其分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 血清饑餓 U251細(xì)胞 Warburg效應(yīng) 氧化磷酸化

【摘要】：氧化磷酸化是細(xì)胞維持正常生命活動(dòng)的主要供能方式,早期的研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中,腫瘤細(xì)胞以糖酵解為主為細(xì)胞增殖提供能量,這一效應(yīng)被稱為“瓦伯格效應(yīng)”。近年來的研究顯示,不同的腫瘤細(xì)胞其能量代謝方式存在一定的差異,同時(shí)在不同的培養(yǎng)條件和微環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞會(huì)改變其原有的代謝途徑,以適應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此開展腫瘤代謝途徑及分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究對(duì)深入了解和認(rèn)識(shí)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖機(jī)制及腫瘤的臨床治療都有重要的意義。 血清是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的成分,細(xì)胞在無血清或低血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后,細(xì)胞將停滯在G0/G1期,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制。因此血清饑餓培養(yǎng)是體外細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)逆環(huán)境,研究逆境條件下即血清饑餓培養(yǎng)條件下,腫瘤細(xì)胞的能量代謝途徑、氧化磷酸化活性及代謝相關(guān)的基因的表達(dá)變化,將有助于對(duì)腫瘤代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。本研究以293T細(xì)胞和U251細(xì)胞為研究材料,通過不同的呼吸抑制劑處理兩種細(xì)胞,確定其主要的能量代謝途徑。然后研究以糖酵解為主的腫瘤細(xì)胞血清饑餓處理對(duì)其能量代謝途徑、氧化磷酸化活性及其代謝調(diào)控相關(guān)的基因的表達(dá)變化。 本研究用不同濃度的氧化磷酸化電子傳遞鏈抑制劑和乳酸脫氫酶抑制劑處理293T細(xì)胞和U251細(xì)胞后,檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)和ATP水平。通過比對(duì)兩種細(xì)胞對(duì)抑制劑的敏感性確定其能量代謝類型。研究發(fā)現(xiàn)293T細(xì)胞對(duì)寡霉素處理敏感,寡霉素(Oligo)對(duì)293T細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用,說明293T細(xì)胞是以氧化磷酸化為主產(chǎn)生ATP。而糖酵解抑制劑草氨酸(Oa)對(duì)U251細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用,表明U251細(xì)胞以糖酵解為主為細(xì)胞提供能量。隨后,對(duì)以糖酵解為主的U251細(xì)胞進(jìn)行血清饑餓處理不同時(shí)間,分析血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞增殖、ATP水平、呼吸代謝途徑及氧化磷酸化活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)血清饑餓處理后,U251細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制,細(xì)胞被阻滯在G0/G1期；細(xì)胞ATP水平顯著上升,細(xì)胞ROS水平降低。對(duì)代謝相關(guān)的酶活性和表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶(LDH)蛋白表達(dá)及活性下降,丙酮酸脫氫酶(PDH)蛋白表達(dá)及活性升高；細(xì)胞線粒體數(shù)量增加,線粒體DNA拷貝數(shù)增加,線粒體電子傳遞復(fù)合物I活性增強(qiáng)；細(xì)胞氧化磷酸化相關(guān)蛋白(NDUFB8、NDUFA9、VDAC、ND1)含量升高；以上結(jié)果顯示血清饑餓后U251細(xì)胞糖酵解途徑受抑制,氧化磷酸化活性增強(qiáng)。同時(shí)我們又檢測(cè)了細(xì)胞代謝調(diào)控相關(guān)蛋白的表達(dá)水平的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清饑餓后U251細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著降低,C-myc、NRF1、TFAM蛋白含量均有明顯增加；同時(shí)檢測(cè)到細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p27表達(dá)升高、CyclinD1蛋白含量增加、CyclinB1蛋白含量降低。 綜上所述,以糖酵解為主的U251細(xì)胞經(jīng)血清饑餓處理后,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制,細(xì)胞被阻滯在G0/G1期,ATP水平增加,ROS水平降低,細(xì)胞糖酵解途徑受抑制,氧化磷酸化活性增強(qiáng)。調(diào)控其代謝途徑改變的可能的分子機(jī)制是血清饑餓處理使HIF-1α下調(diào),抑制糖酵解途徑,同時(shí)促進(jìn)C-myc蛋白水平上調(diào)。C-myc通過促進(jìn)NRF1的表達(dá),促進(jìn)線粒體轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TFAM上調(diào),進(jìn)而增強(qiáng)線粒體DAN復(fù)制,轉(zhuǎn)錄及翻譯水平,促進(jìn)細(xì)胞氧化磷酸化活性增強(qiáng),細(xì)胞ATP含量升高。U251細(xì)胞在饑餓條件下ATP水平的增加可能是逆境環(huán)境中細(xì)胞維持生存的一種應(yīng)急調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究以U251細(xì)胞研究對(duì)象,通過血清饑餓處理,研究其能量代謝途徑的改變及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制,提示腫瘤細(xì)胞的能量代謝途徑可隨著其培養(yǎng)條件及微環(huán)境的改變而改變,以適應(yīng)新的環(huán)境。同時(shí)對(duì)其分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究將對(duì)深入了解和認(rèn)識(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖機(jī)制及腦腫瘤的臨床治療具有重要意義。
【關(guān)鍵詞】：血清饑餓 U251細(xì)胞 Warburg效應(yīng) 氧化磷酸化
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-7
• 縮略詞對(duì)照表7-11
• 第1章 引言11-24
• 1 細(xì)胞能量代謝11-14
• 1.1 無氧呼吸11-13
• 1.2 有氧呼吸13-14
• 2 線粒體結(jié)構(gòu)與氧化磷酸化14-20
• 2.1 線粒體結(jié)構(gòu)14-15
• 2.2 線粒體功能15
• 2.3 氧化磷酸化活性15-20
• 2.3.1 線粒體數(shù)量15-16
• 2.3.2 線粒體DNA拷貝數(shù)16
• 2.3.3 線粒體蛋白16-17
• 2.3.4 線粒體呼吸鏈的組成17-20
• 3 腫瘤細(xì)胞能量代謝20-23
• 3.1 WARBURG效應(yīng)21-22
• 3.2 CRABTREE效應(yīng)22-23
• 4 研究的目的和意義23-24
• 第2章 材料與方法24-41
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料24-27
• 2.1.1 細(xì)胞株24
• 2.1.2 培養(yǎng)基、血清及胰酶24
• 2.1.3 PCR引物合成24
• 2.1.4 主要試劑及耗材24-26
• 2.1.5 主要儀器26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-41
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)27-28
• 2.2.2 呼吸抑制劑處理細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(MTS)及細(xì)胞ATP含量變化28-29
• 2.2.2.1 呼吸抑制劑處理28-29
• 2.2.2.2 呼吸抑制劑處理細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)(MTS)29
• 2.2.2.3 呼吸抑制劑處理細(xì)胞檢測(cè)ATP含量29
• 2.2.3 細(xì)胞ATP檢測(cè)29-30
• 2.2.4 血清饑餓30
• 2.2.5 細(xì)胞周期流式檢測(cè)30
• 2.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)30-31
• 2.2.7 細(xì)胞ROS流式檢測(cè)31
• 2.2.8 PDH活性檢測(cè)31-32
• 2.2.9 LDH活性檢測(cè)32-33
• 2.2.10 DNA提取33
• 2.2.11 RT-PCR33-35
• 2.2.12 MIT GREEN流式檢測(cè)35
• 2.2.13 免疫熒光35
• 2.2.14 WESTERN BLOT35-39
• 2.2.15 線粒體復(fù)合物I活性檢測(cè)39-41
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-56
• 3.1 293T、U251細(xì)胞能量代謝途徑檢測(cè)41-45
• 3.2 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)和ATP含量的影響45-48
• 3.2.1 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞生長(zhǎng)的影響45-47
• 3.2.2 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞ATP及ROS含量的影響47-48
• 3.3 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞PDH、LDH蛋白表達(dá)及活性的影響48-50
• 3.4 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞氧化磷酸化活性的影響50-55
• 3.4.1 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞線粒體數(shù)目的影響50-51
• 3.4.2 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞線粒體MTDNA的影響51-52
• 3.4.3 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物I活性的影響52-53
• 3.4.4 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞OXPHOS相關(guān)蛋白表達(dá)的影響53-54
• 3.4.5 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞OXPHOS活性調(diào)控蛋白表達(dá)的影響54-55
• 3.5 血清饑餓對(duì)U251細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響55-56
• 第4章 討論56-58
• 4.1 腫瘤代謝途徑的多樣性56
• 4.2 培養(yǎng)條件和微環(huán)境影響腫瘤代謝途徑56
• 4.3 血清饑餓U251細(xì)胞通過降低HIF-1α升高增加細(xì)胞ATP含量56-58
• 結(jié)論58-60
• 參考文獻(xiàn)60-63
• 附錄1：常見溶液的配制方法63-65
• 附錄2：碩士研究生期間論文發(fā)表和項(xiàng)目參與情況65-66
• 致謝66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉岷,鄺勝利;缺氧誘導(dǎo)因子活性的調(diào)節(jié)[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2004年01期

2 羅蘭,何云剛,舒坤賢,賴建華,譚德勇,張虹;血清對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251基因表達(dá)的影響[J];云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2000年02期

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本文編號(hào)：961830