本文關鍵詞：突變型p53的轉錄調控作用研究

  更多相關文章： 突變型p53 Sp1 轉錄調控 結合基序 染色質免疫共沉淀

【摘要】：在50%以上的腫瘤組織中,TP53基因發(fā)生了突變。絕大多數的p53突變是發(fā)生在DNA結合結構域上的錯義突變。突變型p53不但失去了腫瘤抑制功能,而且還獲得了新的致癌功能,這種獲得性功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段發(fā)揮著重要的促進作用。突變型p53可能與細胞內的其他蛋白相互作用調節(jié)新的靶基因,但具體機制尚不清楚。本論文關于突變型p53轉錄調控分子網絡的研究,可以深化對腫瘤發(fā)生發(fā)展的理解,為癌癥預防和治療提供新思路和新策略。我們以乳腺癌細胞系MDA-MB-468(該細胞中p53蛋白的第273位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸,即p53R273H)為研究對象,采用染色質免疫共沉淀結合芯片技術(ChIP-on-chip),全基因組范圍內鑒定p53R273H的靶基因。通過MEME-chip程序對ChIP-on-chip的數據進行分析,得到p53-R273H的潛在結合基序(binding motif)為GGCGG[CT]GGCGGCGGC[GT]GCGG[CG]。這個序列不同于野生型p53結合基序,而與Sp1的結合基序重疊。我們還對p53R273H的靶基因進行了基因組定位、基因注釋、KEGG信號通路分析、相互作用網絡構建等生物信息學分析,發(fā)現(xiàn)除了Y和21號染色體上的靶基因較少之外,p53R273H的靶基因幾乎在其它染色體上平均分布。p53R273H的靶基因主要是細胞周期以及增殖過程相關的基因,參與Wnt、TGF-beta和MAPK等信號通路。從我們構建的網絡連接圖來看,基因連接度較高的hub基因也主要是Wnt、TGF-beta和MAPK等信號通路中的基因。由于我們發(fā)現(xiàn)p53R273H的結合基序和Sp1的結合基序重疊,因此,我們推測p53R273H可能通過Sp1的介導調控基因轉錄,或者與Sp1共同調節(jié)基因轉錄。于是,我們用內源和外源的免疫共沉淀實驗檢測Sp1和p53R273H的相互作用,發(fā)現(xiàn)p53R273H和Sp1確實有相互作用。接下來,我們構建了Sp1的轉錄活性報告質粒(含有4個Sp1的結合序列),并分別和野生型p53以及p53R273H突變體的表達質粒共轉染,發(fā)現(xiàn)轉染p53R273H后熒光值顯著增加,并隨著轉染量的增加而增加,且在有Sp1存在的情況下熒光素酶活性比Sp1不存在的情況下熒光值高。而轉染野生型p53后熒光值下降。這些結果說明野生型p53抑制轉錄因子Sp1的活性,而p53-R273H突變體顯著增強轉錄因子Sp1的活性。以上結果說明,有可能p53R273H通過與Sp1相互作用,調控Wnt、TGF-beta和MAPK等信號通路中的關鍵基因,促進癌癥的發(fā)生發(fā)展。
【關鍵詞】：突變型p53 Sp1 轉錄調控 結合基序 染色質免疫共沉淀
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1 前言10-19
• 1.1 突變型p5310-14
• 1.1.1 突變型p53簡介10-11
• 1.1.2 突變型p53在癌癥發(fā)生中的作用11-14
• 1.2 Sp1基因14-18
• 1.2.1 Sp1簡介14-16
• 1.2.2 Sp1在癌癥中的作用16-18
• 1.3 本課題的研究意義18-19
• 2 材料與方法19-29
• 2.1 材料19-20
• 2.1.1 細胞株和菌種19
• 2.1.2 載體和工具酶19
• 2.1.3 試劑盒19
• 2.1.4 抗體19-20
• 2.1.5 其它試劑20
• 2.2 方法20-29
• 2.2.1 質粒構建20-21
• 2.2.2 CHIP-on-chip21-23
• 2.2.3 細胞培養(yǎng)23-24
• 2.2.4 免疫共沉淀24-25
• 2.2.5 熒光素酶分析25-26
• 2.2.6 p53R273H靶全基因組定位26
• 2.2.7 基因注釋（Gene Ontology，GO）分析26-27
• 2.2.8 基因作用網絡分析27-28
• 2.2.9 Pathway分析方法28
• 2.2.10 Peak附近區(qū)域序列提取及motif分析28-29
• 3 結果與分析29-38
• 3.1 ChIP-on-chip篩選p53R273H的靶基因29-30
• 3.2 p53R273H靶基因的基因注釋（gene ontology，，GO）30-31
• 3.3 p53R273H的靶基因的信號通路分析31-32
• 3.4 p53R273H的靶基因的作用網絡分析32-34
• 3.5 p53R273H的結合基序分析34-35
• 3.6 p53R273H與Sp1的相互作用35-36
• 3.7 p53R273H促進Sp1的轉錄活性36-38
• 4 討論38-40
• 參考文獻40-44
• 附錄44-45
• 致謝45

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