發(fā)布時間：2017-10-03 01:29

  本文關(guān)鍵詞：突變型p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用研究

  更多相關(guān)文章： 突變型p53 Sp1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 結(jié)合基序 染色質(zhì)免疫共沉淀

【摘要】：在50%以上的腫瘤組織中,TP53基因發(fā)生了突變。絕大多數(shù)的p53突變是發(fā)生在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的錯義突變。突變型p53不但失去了腫瘤抑制功能,而且還獲得了新的致癌功能,這種獲得性功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個階段發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。突變型p53可能與細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白相互作用調(diào)節(jié)新的靶基因,但具體機(jī)制尚不清楚。本論文關(guān)于突變型p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)的研究,可以深化對腫瘤發(fā)生發(fā)展的理解,為癌癥預(yù)防和治療提供新思路和新策略。我們以乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468(該細(xì)胞中p53蛋白的第273位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸,即p53R273H)為研究對象,采用染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合芯片技術(shù)(ChIP-on-chip),全基因組范圍內(nèi)鑒定p53R273H的靶基因。通過MEME-chip程序?qū)hIP-on-chip的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到p53-R273H的潛在結(jié)合基序(binding motif)為GGCGG[CT]GGCGGCGGC[GT]GCGG[CG]。這個序列不同于野生型p53結(jié)合基序,而與Sp1的結(jié)合基序重疊。我們還對p53R273H的靶基因進(jìn)行了基因組定位、基因注釋、KEGG信號通路分析、相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)除了Y和21號染色體上的靶基因較少之外,p53R273H的靶基因幾乎在其它染色體上平均分布。p53R273H的靶基因主要是細(xì)胞周期以及增殖過程相關(guān)的基因,參與Wnt、TGF-beta和MAPK等信號通路。從我們構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)連接圖來看,基因連接度較高的hub基因也主要是Wnt、TGF-beta和MAPK等信號通路中的基因。由于我們發(fā)現(xiàn)p53R273H的結(jié)合基序和Sp1的結(jié)合基序重疊,因此,我們推測p53R273H可能通過Sp1的介導(dǎo)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄,或者與Sp1共同調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。于是,我們用內(nèi)源和外源的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Sp1和p53R273H的相互作用,發(fā)現(xiàn)p53R273H和Sp1確實(shí)有相互作用。接下來,我們構(gòu)建了Sp1的轉(zhuǎn)錄活性報告質(zhì)粒(含有4個Sp1的結(jié)合序列),并分別和野生型p53以及p53R273H突變體的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p53R273H后熒光值顯著增加,并隨著轉(zhuǎn)染量的增加而增加,且在有Sp1存在的情況下熒光素酶活性比Sp1不存在的情況下熒光值高。而轉(zhuǎn)染野生型p53后熒光值下降。這些結(jié)果說明野生型p53抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp1的活性,而p53-R273H突變體顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的活性。以上結(jié)果說明,有可能p53R273H通過與Sp1相互作用,調(diào)控Wnt、TGF-beta和MAPK等信號通路中的關(guān)鍵基因,促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：突變型p53 Sp1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 結(jié)合基序 染色質(zhì)免疫共沉淀
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2;Q78
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1 前言10-19
• 1.1 突變型p5310-14
• 1.1.1 突變型p53簡介10-11
• 1.1.2 突變型p53在癌癥發(fā)生中的作用11-14
• 1.2 Sp1基因14-18
• 1.2.1 Sp1簡介14-16
• 1.2.2 Sp1在癌癥中的作用16-18
• 1.3 本課題的研究意義18-19
• 2 材料與方法19-29
• 2.1 材料19-20
• 2.1.1 細(xì)胞株和菌種19
• 2.1.2 載體和工具酶19
• 2.1.3 試劑盒19
• 2.1.4 抗體19-20
• 2.1.5 其它試劑20
• 2.2 方法20-29
• 2.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建20-21
• 2.2.2 CHIP-on-chip21-23
• 2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)23-24
• 2.2.4 免疫共沉淀24-25
• 2.2.5 熒光素酶分析25-26
• 2.2.6 p53R273H靶全基因組定位26
• 2.2.7 基因注釋（Gene Ontology，GO）分析26-27
• 2.2.8 基因作用網(wǎng)絡(luò)分析27-28
• 2.2.9 Pathway分析方法28
• 2.2.10 Peak附近區(qū)域序列提取及motif分析28-29
• 3 結(jié)果與分析29-38
• 3.1 ChIP-on-chip篩選p53R273H的靶基因29-30
• 3.2 p53R273H靶基因的基因注釋（gene ontology，，GO）30-31
• 3.3 p53R273H的靶基因的信號通路分析31-32
• 3.4 p53R273H的靶基因的作用網(wǎng)絡(luò)分析32-34
• 3.5 p53R273H的結(jié)合基序分析34-35
• 3.6 p53R273H與Sp1的相互作用35-36
• 3.7 p53R273H促進(jìn)Sp1的轉(zhuǎn)錄活性36-38
• 4 討論38-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 附錄44-45
• 致謝45

【相似文獻(xiàn)】

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5 曹汐汐;徐t煷

本文編號：962415