本文關(guān)鍵詞：GSTA1在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其功能研究

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【摘要】：目前,肺癌是全世界發(fā)病率和致死率均為最高的惡性腫瘤之一,也為我國第一大癌癥,其發(fā)病率和死亡率的增長最為迅速。但是,由于其起病隱匿,尚無有效的可用于肺癌早期診斷手段和篩查的腫瘤標(biāo)志物,導(dǎo)致了其預(yù)后和3年、5年生存率遠(yuǎn)不盡人意。要降低肺癌病人的死亡率,除了在病因預(yù)防上降低發(fā)病率外,發(fā)現(xiàn)特異性的肺癌腫瘤標(biāo)志物,提高早期診斷水平,顯得尤為重要。迄今為止,肺癌的診斷和篩查還是依賴于分子影像診斷(包括X線、CT、MRI和PET-CT),血清酶學(xué)、生化檢測(包括血清中的腫瘤標(biāo)志物、生化酶學(xué)和免疫學(xué)指標(biāo)等),而診斷惡性腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是組織切片、免疫組織化學(xué)等分子病理學(xué)方法,分子影像學(xué)在亞臨床期(腫瘤較小或者缺乏臨床癥狀時)診斷上有很大的局限性,以血清腫瘤標(biāo)志物和組織分子標(biāo)志物為觀察指標(biāo),比影像學(xué)能更早檢測和發(fā)現(xiàn)腫瘤。因此,在肺癌早期診斷技術(shù)的研究中,篩選及確認(rèn)肺癌特異性的腫瘤標(biāo)志物一直是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。我們課題組前期利用噬菌體展示肽庫技術(shù)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合多肽,并以此為基礎(chǔ),篩選肺癌c DNA文庫,最后發(fā)現(xiàn)了肺癌相關(guān)腫瘤抗原—GSTA1,關(guān)于GSTA1在肺癌中的病理生理意義,國內(nèi)外文獻(xiàn)均鮮見報道,因此,本課題系統(tǒng)研究了GSTA1對肺癌增殖和凋亡的影響,并闡明其機(jī)制。第一章采用激光共聚焦掃描顯微鏡初步驗(yàn)證GSTA1蛋白在肺癌細(xì)胞A549、SPCA1和MRC-5等細(xì)胞株中的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,GSTA1蛋白定位于細(xì)胞膜,而且其在癌細(xì)胞中的表達(dá)量高于肺正常細(xì)胞MRC-5。采用Western blotting和Real-time PCR進(jìn)一步驗(yàn)證GSTA1的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平,結(jié)果顯示,各種不同的癌細(xì)胞(肺癌A549、H460、SPCA1、LTEP-A2、肝癌Hep G2)的m RNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量都明顯高于MRC-5細(xì)胞,特別是肺腺癌細(xì)胞A549在所檢測的癌細(xì)胞中,表達(dá)量是最高的,因此,選取A549細(xì)胞作為下一步研究GSTA1功能的主要細(xì)胞株。第二章體外RNAi干擾GSTA1在肺癌細(xì)胞A549的表達(dá),利用Western blotting和Real-time PCR篩選干擾效果最優(yōu)的si RNA,構(gòu)建干擾GSTA1表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體(Si-GSTA1組)和包裝GSTA1質(zhì)粒的慢病毒過表達(dá)載體(GSTA1組),轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,利用MTT、Hoechest33258和流式細(xì)胞儀觀察GSTA1對肺癌細(xì)胞生長的影響。結(jié)果顯示,GSTA1高表達(dá)促進(jìn)了肺癌細(xì)胞A549的增殖,反之,如果沉默GSTA1的表達(dá)抑制了A549細(xì)胞的增殖,促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。第三章研究GSTA1表達(dá)對A549細(xì)胞株裸鼠移植瘤的影響,分別將已構(gòu)建好的Si-GSTA1慢病毒表達(dá)載體和GSTA1過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染至人肺癌A549細(xì)胞株,隨后將該細(xì)胞接種于裸鼠左腋皮下,建立荷人肺癌裸鼠模型,在3周內(nèi)每周測量一次腫瘤組織體積及重量,繪制成腫瘤生長曲線。分別采用Western blotting和Real-time PCR檢測移植瘤組織中GSTA1蛋白質(zhì)和m RNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示,GSTA1過表達(dá)組的成瘤能力和生長速度均明顯高于對照組,腫瘤體積和重量均高于其對照組(p0.05),相反,Si-GSTA1組成瘤能力和生長能力、腫瘤體積和重量均低于其對照組(p0.05);Western blotting和Real-time PCR結(jié)果顯示,GSTA1組腫瘤組織GSTA1蛋白表達(dá)水平和m RNA表達(dá)水平均明顯高于對照組(p0.05),Si-GSTA1組的腫瘤組織蛋白表達(dá)水平和m RNA表達(dá)水平均明顯低于其對照組(p0.05)。這表明,下調(diào)GSTA1的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力。我們從體外、體內(nèi)分別探索了GSTA1對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),GSTA1過表達(dá)可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長,提示在組織中檢測GSTA1表達(dá)量可以預(yù)測肺癌組織的惡性程度。第四章采用MTT方法檢測芹菜素對肺癌細(xì)胞增殖的影響,Hoechst33258檢測芹菜素對肺癌細(xì)胞核形態(tài)學(xué)的變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測芹菜素對肺癌細(xì)胞凋亡率的影響,利用Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)情況。芹菜素作用不同肺癌細(xì)胞48 h后,采用Western blotting和Real-time PCR檢測對GSTA1蛋白表達(dá)和m RNA表達(dá)的影響,以研究GSTA1在芹菜素介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。結(jié)果顯示,芹菜素呈濃度和時間的依賴性地抑制肺癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡。Western blotting和Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,芹菜素能下調(diào)不同肺癌細(xì)胞GSTA1蛋白質(zhì)和基因表達(dá)水平(p0.05),這表明芹菜素可能通過抑制GSTA1的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。綜上結(jié)果表明,GSTA1高表達(dá)可能促進(jìn)人肺癌的發(fā)生與發(fā)展,不僅可以作為有輔助診斷價值肺癌新的腫瘤標(biāo)志物,同時,GSTA1也可作為人肺癌治療的一個潛在藥物靶點(diǎn)。芹菜素來源于食物提取物,具有低毒、來源廣、價廉物美的優(yōu)點(diǎn),可以通過抑制GSTA1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡,有望成為天然化合物類的抗腫瘤新藥。
【關(guān)鍵詞】：肺癌 腫瘤標(biāo)志物 GSTA1 芹菜素
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文縮略語11-12
• 引言12-16
• 第一章 GSTA1在肺癌細(xì)胞中的定位及表達(dá)水平檢測16-31
• 1 材料17-19
• 2 方法19-26
• 3 結(jié)果26-29
• 4 討論29-31
• 第二章 體外研究GSTA1表達(dá)水平對肺癌細(xì)胞生長的影響31-47
• 1 材料31-32
• 2 方法32-36
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-43
• 4 討論43-47
• 第三章 GSTA1對A549細(xì)胞株裸鼠移植瘤影響的初步研究47-54
• 1 材料47
• 2 實(shí)驗(yàn)方法47-48
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-51
• 4 討論51-54
• 第四章 芹菜素處理對A549細(xì)胞GSTA1表達(dá)的影響54-68
• 1 材料54-55
• 2 實(shí)驗(yàn)方法55-56
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-66
• 4 討論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-78
• 結(jié)論與創(chuàng)新性78-79
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的主要論文79-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：959745