本文關(guān)鍵詞：核酸適配體修飾的納米顆粒在腫瘤靶向免疫治療及靶向熱療中的應(yīng)用

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【摘要】：目的：MUC1是一種重要的糖蛋白,它在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá),如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、直腸癌和前列腺癌,但在正常細(xì)胞表面表達(dá)水平較低,使它成為腫瘤靶向治療中一種重要的靶標(biāo)。目前已經(jīng)報道過一些針對MUC1陽性腫瘤的靶向治療方法,如針對MUC1蛋白的靶向給藥系統(tǒng)以及單克隆抗體等,但通過靶向性地動員NK細(xì)胞(natural killer celis)來殺傷MUC1陽性的腫瘤細(xì)胞尚未見文獻(xiàn)報道。NK細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān),某些情況下還參與超敏反應(yīng)和自身免疫調(diào)節(jié)病的發(fā)生。本課題設(shè)計了一種修飾有MUC1和CD16核酸適配體的兩親性納米顆粒,可同時結(jié)合CD16陽性的NK細(xì)胞和MUC1陽性的腫瘤細(xì)胞,并將兩種細(xì)胞拉近。此外,我們還在體外探索了該兩親性納米顆粒能否靶向性的增強(qiáng)NK細(xì)胞對MUC1陽性腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用。方法：CD16核酸適配體和MUC1核酸適配體通過鏈霉素-親和素之間的特異性結(jié)合到反應(yīng)連接到納米顆粒表面形成兩親性納米顆粒,該顆�？梢酝瑫r結(jié)合CD16陽性的自然殺傷細(xì)胞(NK)和MUC1陽性的腫瘤細(xì)胞,并將這兩種細(xì)胞拉近,從而靶向性的增強(qiáng)NK對這些腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)用來檢測兩種核酸適配體與各自靶細(xì)胞的結(jié)合情況；DNA雜交實驗用來檢測核酸適配體與納米粒子的連接；動態(tài)光散射實驗用來檢測兩親性納米粒的尺寸及分布；共聚焦顯微鏡用來觀察兩親性納米顆粒的形態(tài)；競爭實驗用來檢測適配體修飾的兩親性納米粒與靶細(xì)胞的結(jié)合情況；暗視野顯微鏡用來觀察兩親性納米粒子是否可以將兩種細(xì)胞拉近；細(xì)胞活性實驗用來檢測兩親性納米粒子是否可以靶向性的增強(qiáng)NK對MCU1陽性腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用。結(jié)果：本實驗構(gòu)建了一種修飾有CD16和MUC1核酸適配體的兩親性納米粒子(CD16-NP-MUC1),可同時結(jié)合NK和MUC1陽性腫瘤細(xì)胞,并拉近兩種細(xì)胞的距離；流式細(xì)胞術(shù)顯示CD16核酸適配體可結(jié)合外周血單個核細(xì)胞中的自然殺傷細(xì)胞,MUC1核酸適配體可結(jié)合MUC1陽性的A549腫瘤細(xì)胞,而不結(jié)合MUC1陰性的MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞；DNA雜交實驗顯示CD16和MUC1核酸適配體已被組裝到了納米顆粒上；動態(tài)光散射實驗顯示兩親性納米顆粒的平均尺寸為574 nm并且呈單峰分布；共聚焦顯微鏡顯示兩親性納米顆粒呈近圓形；競爭實驗顯示修飾有適配體的納米粒子可結(jié)合靶細(xì)胞；暗視野顯微鏡觀察到兩親性納米粒子可以靶向性地募集NK到MUC1陽性腫瘤細(xì)胞附近；細(xì)胞活性實驗顯示兩親性納米粒子可以增強(qiáng)NK對MUC1陽性細(xì)胞A549的免疫殺傷作用,而對MUC1陰性細(xì)胞MDA-MB-231沒有影響。結(jié)論：修飾有CD16和MUC1適配體的兩親性納米粒子可拉近NK和MUC1陽性腫瘤細(xì)胞,在體外靶向性地增強(qiáng)NK對MUC1陽性腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用。通過募集NK來靶向性地殺傷MUC1陽性腫瘤細(xì)胞這一策略在研發(fā)新型針對MUC1的靶向免疫療法中有應(yīng)用潛能。目的：神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的成人原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤,其中惡性成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是最具有侵襲力的一種,患者生存時間極短。由于惡性成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤致死率高,且對正常組織細(xì)胞有很強(qiáng)的侵襲力,傳統(tǒng)治療如手術(shù)、化療、放療等很難將其根除,因此迫切需要探索一種新型的針對惡性成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療方法。腫瘤的熱療是繼手術(shù)、放療、化療、免疫療法以外的第五種重要療法,該療法是利用高溫環(huán)境使腫瘤細(xì)胞發(fā)生不可逆的變化導(dǎo)致其凋亡。傳統(tǒng)的腫瘤熱療所使用的熱敏劑缺乏腫瘤靶向性,常損傷正常組織,因此目前急需探索新型的靶向腫瘤熱療方法。核酸適配體是近幾年被廣泛研究的靶向分子,它能以較強(qiáng)的特異性和較高的親和力同靶標(biāo)分子結(jié)合,被廣泛研究應(yīng)用與腫瘤靶向給藥系統(tǒng)及腫瘤的早期診斷。本課題構(gòu)建了一種新型的核酸適配體修飾的鐵納米粒子(Apt-NP),并首次探索了該粒子在體外對人惡性成膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的靶向熱療效應(yīng)。方法：流式細(xì)胞術(shù)用來檢測該核酸適配體的特異性和對靶細(xì)胞的結(jié)合能力；熒光DNA探針雜交實驗檢測核酸適配體是否結(jié)合到了納米粒子表面；動態(tài)光散射粒徑儀分析核酸適配體修飾的鐵納米粒的尺寸分布；鐵染色法檢測核酸適配體修飾的鐵納米粒結(jié)合靶細(xì)胞的能力；通過檢測磁場條件下細(xì)胞釋放的乳酸脫氫酶來評估體外核酸適配體修飾的鐵納米粒的靶向熱療效應(yīng)。結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)顯示本課題選用的核酸適配體可以特異性的結(jié)合人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞；DNA熒光探針雜交實驗顯示該核酸適配體確實組裝到了鐵納米磁珠上；動態(tài)光散射粒徑儀顯示該核酸適配體的平均直徑為574 nm；鐵染色顯示該核酸適配體修飾的鐵納米粒較強(qiáng)結(jié)合人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞；乳酸脫氫酶釋放檢測實驗顯示在體外交變磁場的條件下,核酸適配體修飾的鐵納米�？梢燥@著提升對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的熱療殺傷效應(yīng)(P0.05),而對照的MD-MBA-231細(xì)胞的熱療效應(yīng)沒有明顯增強(qiáng)。結(jié)論：核酸適配體修飾鐵納米�？梢燥@著提升對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的熱療殺傷作用,在腫瘤靶向熱療方面具有潛在的應(yīng)用價值。
【關(guān)鍵詞】：MUC1 CD16 納米材料 核酸適配體 免疫治療 靶向治療 核酸適配體 熱療 人膠質(zhì)細(xì)胞瘤
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 第一部分 核酸適配體修飾的鐵納米顆粒靶向性的提升NK對MUC1陽性腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷作用6-43
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-17
• 1. MUC1陽性腫瘤的治療手段10-11
• 2. MUC1蛋白11-12
• 3. 免疫治療及自然殺傷細(xì)胞12
• 4. 核酸適配體12-13
• 5. 納米技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用13-14
• 6. 選題依據(jù)以及意義14
• 7. 研究策略以及技術(shù)路線14-15
• 8. 技術(shù)路線15-17
• 第二章 材料與方法17-27
• 1. 主要材料和試劑17-20
• 1.1 人外周血來源17
• 1.2 細(xì)胞系17
• 1.3 順磁性氧化鐵納米顆粒17
• 1.4 單鏈寡核苷酸和引物17-18
• 1.5 細(xì)胞培養(yǎng)試劑18-19
• 1.6 試劑盒19
• 1.7 化學(xué)試劑19
• 1.8 溶液的配置19-20
• 1.9 細(xì)胞培養(yǎng)耗材20
• 2. 實驗儀器和設(shè)備20-21
• 3. 實驗方法21-27
• 3.1 人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離21
• 3.2 細(xì)胞培養(yǎng)21
• 3.3 MUC1-NP-CD16復(fù)合物的構(gòu)建21-22
• 3.3.1 核酸適配體的擴(kuò)增21-22
• 3.3.2 構(gòu)建兩親性MUC1-NP-CD16復(fù)合物22
• 3.4 MUC1-NP-CD16的表征檢測22-23
• 3.4.1 利用激光共聚焦顯微鏡評估MUC1-NP-CD16復(fù)合物的形態(tài)22
• 3.4.2 利用動態(tài)光散射粒徑儀評估MUC1-NP-CD16復(fù)合物的大小22-23
• 3.5 流式檢測23-24
• 3.5.1 流式檢測MUC1和CD16核酸適配體的親和特性23
• 3.5.2 流式檢測MUC1和CD16核酸適配體是否連接到鐵納米粒上23-24
• 3.6 相差顯微鏡成像分析檢測24
• 3.7 競爭實驗24
• 3.8 免疫殺傷實驗24-26
• 3.8.1 MUC1-NP-CD16影響NK細(xì)胞對MUC1陽性肺癌細(xì)胞A549的免疫殺傷的研究24-25
• 3.8.2 MUC1-NP-CD16影響NK細(xì)胞對MUC1陰性乳腺癌細(xì)胞MD-MBA-231的免疫殺傷的研究25-26
• 3.9 統(tǒng)計學(xué)處理26-27
• 第三章 實驗結(jié)果與分析27-38
• 1. 兩親性納米粒的構(gòu)建27-28
• 2. PCR制備核酸適配體28-29
• 3. 核酸適配體特異性的檢測29-30
• 4. 核酸適配體同納米粒的連接30-32
• 5. 兩親性納米粒的表征32-33
• 6. 核酸適配體修飾的納米顆粒能夠結(jié)合靶細(xì)胞33-34
• 7. 兩親性納米顆�？梢阅技疦K到A549細(xì)胞附近34-35
• 8. 兩親性納米顆粒影響NK免疫殺傷作用的研究35-38
• 第四章 討論與結(jié)論38-40
• 1. 討論38-39
• 2. 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 第二部分 核酸適配體修飾的鐵納米粒對人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的靶向熱療效應(yīng)43-71
• 摘要43-45
• Abstract45-47
• 第一章 前言47-52
• 1. 神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療47-48
• 2. 表皮生長因子受體突變體Ⅲ型48
• 3. 腫瘤熱療48-49
• 4. 課題設(shè)計49-50
• 5. 研究策略50
• 6. 技術(shù)路線50-52
• 第二章 材料與方法52-58
• 1. 主要材料和試劑52-54
• 2. 實驗儀器和設(shè)備54-55
• 3. 實驗方法55-58
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)55
• 3.2 Apt-NP的構(gòu)建55-56
• 3.3 流式檢測56
• 3.4 表征檢測56
• 3.5 吸光度值檢測56
• 3.6 Apt-NP熱療效率檢測56-57
• 3.7 統(tǒng)計學(xué)分析57-58
• 第三章 實驗結(jié)果與分析58-66
• 1. PCR制備核酸適配體58-59
• 2. 核酸適配體的結(jié)合性質(zhì)分析59-60
• 3. Apt-NP的構(gòu)建60-62
• 4. Apt-NP的尺寸表征62
• 5. Apt-NP特異性地結(jié)合人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞62-64
• 6. Apt-NP對熱療效果的靶向調(diào)節(jié)作用64-66
• 第四章 討論與結(jié)論66-68
• 1. 討論66-67
• 2. 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 附錄一 英文縮略詞匯表71-73
• 附錄二 個人簡歷73-74
• 致謝74-76

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本文編號：954920