本文關(guān)鍵詞：基于Skp2為靶點(diǎn)的抗腫瘤多肽藥物的篩選

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【摘要】：目的:惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。目前臨床抗腫瘤藥物常常有療效不佳,毒副反應(yīng)較大的特點(diǎn)。抗腫瘤肽類藥物或蛋白類藥物與傳統(tǒng)小分子藥物相比有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì):能特異性地有效干擾靶蛋白的作用和功能,毒副反應(yīng)輕,研發(fā)成本相對(duì)較低。Skp2是一調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的激酶相關(guān)蛋白,它通過對(duì)多種靶蛋白的泛素化降解作用而參與細(xì)胞周期的調(diào)控,其功能的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。因此,本文擬以Skp2為靶點(diǎn),采用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)我們已構(gòu)建好的人源化肽適配體文庫(kù)進(jìn)行篩選,旨在尋找有效的抗腫瘤肽類藥物。方法和結(jié)果:1.多肽適配體文庫(kù)的篩選:以人Skp2蛋白的LRR區(qū)(208aa-390aa)為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)人源化多肽適配體文庫(kù)進(jìn)行篩選。我們首先篩選到特異性結(jié)合Skp2的肽適配體一百多個(gè),經(jīng)質(zhì)粒提取測(cè)序后,確定了11個(gè)正確編碼的多肽用于后期實(shí)驗(yàn)。2.檢測(cè)多肽適配體的抗腫瘤效應(yīng):首先分別檢測(cè)胃癌細(xì)胞系(AGS、MKN28、MKN45、SGC7901)、乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7、MDA-MB-231)、肺癌細(xì)胞系(H23、H1299、A549、H292、SPC-A1)以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(H4、SH-SY5Y、SK-N-SH、U251)的Skp2及其底物的蛋白和mRNA表達(dá)水平,然后將Skp2表達(dá)量相對(duì)較高且其底物表達(dá)量相對(duì)較低的細(xì)胞株用于后續(xù)檢測(cè)多肽適配體的抗腫瘤作用。結(jié)果表明,肺癌細(xì)胞株A549符合這一要求。3.多肽適配體與Skp2相互作用的驗(yàn)證:將通過酵母雙雜交篩選得到的多肽適配體亞克隆到帶His標(biāo)簽的表達(dá)載體上,體外NI-柱純化蛋白。構(gòu)建帶GST標(biāo)簽的Skp2表達(dá)載體,并純化蛋白,然后在體外與純化的肽適配體進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn),確定其與Skp2之間的體外作用關(guān)系。4.快速篩選有抑癌作用的肽適配體:將肽適配體構(gòu)建到真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞,通過CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率,軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞非錨定生長(zhǎng)增殖能力以探查肽適配體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡,分析多肽對(duì)細(xì)胞周期的影響;Western Blot檢測(cè)Skp2及其底物的變化。結(jié)果表明,采用真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),觀察到11個(gè)多肽適配體蛋白中的3個(gè)多肽蛋白(即小分子多肽6-1、8-1和23-5)可有效地抑制Skp2對(duì)其底物p27或p21的降解。功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示,上述3個(gè)多肽適配體蛋白能有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)論:我們以人Skp2蛋白的LRR區(qū)為誘餌蛋白,利用酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)人源化多肽適配體文庫(kù)進(jìn)行篩選,并成功地篩選出3個(gè)多肽蛋白(即小分子多肽6-1、8-1和23-5)可有效地抑制Skp2對(duì)其底物p27或p21的降解及明顯抑制腫瘤生長(zhǎng),提示這些多肽蛋白有望進(jìn)一步開發(fā)出可能的新的抗腫瘤藥物。
【關(guān)鍵詞】：Skp2 肽適配體 抗腫瘤 藥物
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.53
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第1章 緒論11-16
• 1.1 研究背景11
• 1.2 Skp2與腫瘤11-16
• 1.2.1 Skp2結(jié)構(gòu)與功能11-14
• 1.2.2 小分子多肽14-15
• 1.2.3 Skp2的多種底物15-16
• 第2章 主要方法和設(shè)計(jì)流程16-35
• 2.1 引言16
• 2.2 主要方法16-31
• 2.2.1 酵母雙雜交16-17
• 2.2.2 分子克隆17-18
• 2.2.3 Gel Extraction（OMEGA試劑盒）18-19
• 2.2.4 轉(zhuǎn)化19-20
• 2.2.5 小分子多肽基因合成20-21
• 2.2.6 反轉(zhuǎn)錄（TAKARA試劑盒）21
• 2.2.7 Q-PCR21-22
• 2.2.8 瓊脂糖凝膠電泳22-23
• 2.2.9 凝膠成像系統(tǒng)分析23
• 2.2.10 Plasmid Isolation（OMEGA小提試劑盒）23
• 2.2.11 Plasmid Isolation（TIANGEN大提試劑盒）23-24
• 2.2.12 RNA提取（Trizol提取法）24-25
• 2.2.13 Superfectin Transfection （普飛生物）25
• 2.2.14 磷酸鈣轉(zhuǎn)染25-26
• 2.2.15 PEI Transfection26
• 2.2.16 Western Blot26-28
• 2.2.17 超聲破碎28-29
• 2.2.18 NI-柱純化29
• 2.2.19透析29
• 2.2.20 BCA蛋白定量29-30
• 2.2.21 PI染色細(xì)胞周期30
• 2.2.22 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.2.23 GST-pull down實(shí)驗(yàn)31
• 2.3 試劑及設(shè)備31-34
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑31-33
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備33-34
• 2.4 設(shè)計(jì)流程34-35
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-55
• 3.1 引言35
• 3.2 酵母雙雜交35-36
• 3.3 小分子多肽構(gòu)建及純化36-40
• 3.3.1 多肽適配體及支架蛋白的原核表達(dá)載體的構(gòu)建36-39
• 3.3.2 多肽適配體的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及純化39-40
• 3.4 體外相互作用機(jī)制研究40-42
• 3.4.1 GST標(biāo)簽及標(biāo)簽蛋白Skp2的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)40-41
• 3.4.2 GST-pull down實(shí)驗(yàn)體外驗(yàn)證多肽和Skp2之間相互作用41-42
• 3.5 腫瘤細(xì)胞系的篩選42-46
• 3.5.1 肺癌細(xì)胞系Skp2和底物的mRNA和蛋白水平42-44
• 3.5.2 胃癌、乳腺癌細(xì)胞系Skp2和底物的mRNA和蛋白水平44-45
• 3.5.3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系Skp2和底物的mRNA和蛋白水平45-46
• 3.5.4 細(xì)胞系的確定46
• 3.6 功能多肽的篩選46-51
• 3.6.1 純化蛋白濃度的測(cè)定46-47
• 3.6.2 多肽適配體給藥47
• 3.6.3 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法的確定47-48
• 3.6.4 A549細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染多肽后Skp2底物蛋白變化48-49
• 3.6.5 HeLa轉(zhuǎn)染方法篩選49-50
• 3.6.6 HeLa細(xì)胞系中梯度轉(zhuǎn)染多肽后Skp2底物蛋白變化50-51
• 3.7 功能驗(yàn)證51-54
• 3.7.1 多肽適配體 6-1、8-1 和 23-5 對(duì)細(xì)胞周期的影響51-53
• 3.7.2 多肽適配體 6-1、8-1 和 23-5 影響細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)53-54
• 3.8 結(jié)論54-55
• 第4章 討論與展望55-57
• 致謝57-58
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 綜述61-70
• 參考文獻(xiàn)65-70

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